高級別漿液性卵巢癌(HGSC)仍然是一種預后不良的疾病，對目前的免疫檢查點抑制劑無反應。雖然 PI3K 途徑的改變，如 PTEN 缺失，在 HGSC 很常見，但是針對這一途徑的嘗試并不成功。我們假設異常的 PI3K 途徑激活可能改變 HGSC 免疫微環境并提供靶向機會。單細胞 RNA 測序鑒定了小鼠模型中特異于 Pten 無效網膜腫瘤的駐留巨噬細胞群體，流式細胞術證實了這一點。這些巨噬細胞來源于腹腔液巨噬細胞，表現出獨特的基因表達程序，以血紅素加氧酶 -1(HMOX1)的高表達為標志。靶向腹腔巨噬細胞阻止了 HMOX1^hi 巨噬細胞的出現，減少了腫瘤的生長。此外，直接抑制 HMOX1延長體內存活。RNA 測序鑒定了 Pten 缺失腫瘤細胞中的 IL33作為可能的候選驅動因子，導致了 HMOX1hi 巨噬細胞的出現。人類 HGSC 腫瘤中也含有 HMOX1^hi 巨噬細胞及其相應的基因表達程序。此外，這些巨噬細胞的存在與激活的腫瘤 PI3K/mTOR 信號傳導和 HGSC 患者的總生存率差有關。相比之下，HMOX1^hi 巨噬細胞數量少的腫瘤表現為適應性免疫應答基因表達增加。這些數據表明靶向 HMOX1^hi 巨噬細胞是治療不良預后 HGSC 的一種潛在的治療策略。本文于2024年11月發表于《Cancer Immunology》，IF：12.5

研究技術路線：

研究結果：

1. Pten-null細胞依賴于腫瘤微環境加速腫瘤生長

為了解決 PTEN 缺失如何影響 HGSC 生長，我們利用匹配的 ID8細胞，單獨使用 Trp53或我們以前產生的 Trp53和 PTEN 中的失活突變。使用多個單獨的克隆，我們證實在腹膜內注射后，與 Trp53^-/-相比，Trp53^-/-; Pten^-/-ID8細胞導致顯著縮短的存活(圖1A)。如前所述，Pten 缺失在2D 高附著條件下(圖1B 和 C) ，包括具有額外的 Brca2突變(圖1D)以及在低血清和血清饑餓條件下(圖1E) ，提示增強的腹膜內生長不是腫瘤細胞固有的。

腫瘤細胞必須抵抗失巢凋亡，然后在低附著條件下生長，以促進 HGSC 的腹膜播散。Trp53^-/-和 Trp53^-/-; Pten^-/-ID8克隆在體外低附著條件下形成球狀簇，但隨著時間的推移，兩種基因型的收縮率是相等的(圖1F)。在體內，Pten 丟失在腹腔注射后沒有立即的生存優勢(圖1G)。S1C)。然而，注射后14天，腹腔液中 Pten 無效細胞顯著擴增(圖1G)。此外，在注射 Trp53^-/-； Pten^-/-細胞的小鼠中，HGSC 轉移的主要部位網膜中的腫瘤負荷在第14天更大，在第25至28天顯著更大(圖1H)。

為了確保我們的發現不是 ID8特異性的，我們使用了 HGS2，一種由 Trp53^fl/fl，Brca2^fl/fl，Pten^fl/fl，Pax8^Cre 轉基因小鼠中產生的腫瘤產生的細胞系。我們使用慢病毒在 HGS2中重新表達 Pten，這并不影響倍增時間在二維高附著(圖1I)或形成球體的能力在低附著(圖1J)。但與對照病毒感染的細胞相比，在體內產生較小的網膜腫瘤(圖1K)。總之，這些數據強烈表明腹膜微環境支持 Pten 無效腫瘤的加速生長。

Figure 1 Pten-null細胞依賴于腫瘤微環境加速腫瘤生長

2. Pten-null腫瘤細胞增強了網膜內駐留樣巨噬細胞的積累

我們假設巨噬細胞支持 Pten-null腫瘤的播種和生長。在小鼠的腹膜腔和網膜中存在兩個主要的巨噬細胞群體: 不斷由血液 Ly6C^hi 單核細胞補充的 F4/80^loMHCII^hi 單核細胞來源的巨噬細胞和胚胎來源的 F4/80^hiMHCIIl^o 駐留巨噬細胞，它們都是自我維持和從當地的 F4/80^loMHCII^hi 庫中補充的。在確認了我們的門控策略的特殊性之后，我們首先評估了巨噬細胞/單核細胞群在腫瘤生長過程中的變化。ID8細胞注射1天內引起 Ly6C^hi 單核細胞流入腹腔液。在 Trp53^-/-; Pten^-/-注射的小鼠中，這種浸潤在第14天顯著增加(圖2A)。可能來源于該單核細胞庫的 F4/80^loMHCII^hi 巨噬細胞的增加(圖2B)在 Trp53^-/-; Pten^-/-注射后14天也是明顯的。在 Trp53^-/-; Pten^-/-注射的小鼠中，網膜駐留的 F4/80^hiMHCII^lo 群體在第14天增加(圖2C)。有趣的是，在第28天，當兩種基因型都有相當大的腫瘤負荷時，Trp53^-/-; Pten^-/-網膜腫瘤在多個亞克隆中含有顯著更多的駐留樣巨噬細胞(圖2D)。此外，大約40% 的駐留樣巨噬細胞表達長期駐留標記 TIM4 ⁺ ，表明它們不是新招募的(圖2E 和 F)。

我們還使用了具有或不具有 Pten-null的 Trp53^-/-; Brca2^-/-ID8細胞。單獨的 Brca2缺失并不影響駐留巨噬細胞的擴張(圖2G)。然而，Pten 的額外缺失再次顯著增加了駐留巨噬細胞的密度(圖2G) ，這與單核細胞來源的巨噬細胞和 T 細胞的相對缺乏相結合(圖2H 和 I)。這與體內侵略性的增加有關。除了 Pten 之外，Brca2的缺失拯救了單獨使用 Pten 損失觀察到的單核細胞衍生的巨噬細胞和 T 細胞的募集(圖2J 和 K) ，表明 Pten 缺失特異性地改變駐留巨噬細胞而不是誘導免疫微環境中的全局變化。

為了確定駐留巨噬細胞是否是Pten-null網膜腫瘤生長的驅動因素，我們首先在腫瘤接種之前使用腹膜內氯膦酸鹽包封的脂質體(CEL)耗盡所有巨噬細胞。這種泛巨噬細胞的消耗完全阻止了 Trp53^-/-; Pten^-/-網膜腫瘤的形成和腹水的產生(圖2L)。不幸的是，如先前報道的，CEL 注射后觀察到的高死亡率阻礙了我們機構使用 CEL 的進一步研究。為了進一步解剖巨噬細胞對 Pten-null腫瘤生長的貢獻，我們利用缺乏 Ccr2的一個(Ccr2^RFP/+)或兩個拷貝(Ccr2^RFP/RFP)的小鼠，因此顯著減少了骨髓單核細胞的出口。正如預期的那樣，Ccr2^RFP/+ 和 Ccr2^RFP/RFP 小鼠的腹膜液和網膜中的單核細胞和單核細胞來源的巨噬細胞顯著減少，駐留巨噬細胞庫沒有改變。引人注目的是，Ccr2的缺失顯著增加了 Trp53^-/-; Pten^-/-注射的小鼠中的腫瘤負荷和腹水體積(圖2M) ，表明單核細胞衍生的巨噬細胞在 Pten-null腫瘤接種和生長期間具有保護性抗腫瘤作用。

Figure 2 Pten-null的腫瘤細胞增強了網膜內駐留樣巨噬細胞的積累

3. Pten-null腫瘤驅動一個獨特的 HMOX1^hi 巨噬細胞亞群的出現

巨噬細胞表型不能簡化為二元 M1/M2標記物表達，網膜腫瘤中存在多種不同的亞型。因此，我們使用 SMART-Seq2方案對來自網膜腫瘤的流式分選巨噬細胞進行 scRNA-seq。統一流形近似和投影聚類顯示了五個不同的聚類(圖3A 和 B)。簇0表達在單核細胞衍生的巨噬細胞中經典發現的基因，包括 MHCII 相關分子(H2-Eb1，H2-DMb2，H2-DMb1，H2-Ab1，Cd74，H2-Oa 和 H2-Aa) ，趨化因子受體 Ccr2，Cx3cr1和共刺激分子 Cd86。通過流式細胞術，簇0也定位于 F4/80^loMHCII^hi 區(圖3C)。簇1和簇3均表達腹膜巨噬細胞定義的基因。簇1表達 Fcna (ficolin 1) ，Fn1(纖連蛋白1)和類視黃醇 X 受體 Rxra，并且通過流式細胞術主要位于 F4/80^loMHCII^hi 區域(圖3C)。簇3表達更多的經典腹膜駐留基因，包括 Ltbp1，Garnl3，Serpinb2，Alox15，Selp，F5，Timd4，Icam2(CD102)和 Gata6。通過流式細胞術定位于 F4/80^hiMHCII^lo 區域的簇3(圖3C) ，其與 TIM4(Timd4)的表達一起表明簇1是轉變成簇3的單核細胞衍生的前體。簇4表達的基因通常在上皮細胞或間皮細胞(Krt18，Krt19，Msln，Wt1)中發現，這表明它們可能是吞噬巨噬細胞。

最有趣的簇是簇2，它幾乎完全在 Trp53^-/-，Pten^-/-腫瘤中發現(圖3A 和 B) ，并且具有高表達的 HMOX1(Hmox1) ，這是一種酶，催化血紅素分解成一氧化碳，鐵(Fe^{2 +})和膽綠素。簇2還表達參與脂質積累的基因，如 Trib3(Tribbles 假激酶 -3)和 Lgals3(半乳糖凝集素3) ，以及防止重金屬毒性的基因，如金屬硫蛋白 Mt1和 Mt2。簇2還表達了與免疫抑制相關的基因，包括 Cd274(PD-L1) ，Arg1(精氨酸酶1)和 Vegfa。通過流式細胞術，簇2主要定位于 F4/80^hiMHCII^lo 區域，表明它可能來源于腹膜巨噬細胞(圖3C)。我們使用 Monocle3進行假時間分析來估計假定的分化方向。當重新聚集時，選擇第0組作為起始節點，假時間預測第2組來源于第1組和第3組(圖3D) ，表明它代表腹膜駐留巨噬細胞的一個亞型。

我們通過流式細胞術在早期(進行腹水形成)和晚期(存在腹水)時間點證實了這些巨噬細胞亞群的存在(圖3E 和 F)。這證實了在 Trp53^-/-; Pten^-/-腫瘤中早期存在簇2巨噬細胞(定義為 Arginase1⁺ PD-L1⁺ 或 HMOX1^hi) ，并且在晚期腫瘤中顯著增加(圖3G 和 H)。我們還使用 IHC 驗證了 ID8網膜腫瘤切片中 HMOX1⁺ 細胞的存在(圖3I) ，其中它們在脂肪細胞周圍和腫瘤邊界中被觀察到(圖3J)。

我們接下來評估了 HMOX1在簇2中表達的選擇性。使用 Hmox1^GFP 轉基因小鼠，我們證實只有單核細胞和巨噬細胞表達 HMOX1(圖3K)。盡管 LYVE1 ⁺ 間皮細胞襯里群體(占總巨噬細胞的一小部分)具有最高的表達，但是簇2(精氨酸酶1 ⁺ PD-L1 ⁺)高度表達 HMOX1，其次是 CD102 ⁺ 腹膜巨噬細胞。CD11c ⁺ MHCIIhi 單核細胞來源的巨噬細胞和單核細胞表達較弱，其他群體表達較弱或不表達。當組合時，我們的數據顯示精氨酸酶1 ⁺ PD-L1 ⁺ HMOX1^hi 巨噬細胞在 Trp53^-/-; Pten^-/-腫瘤中顯著富集(圖3L)。

Figure 3 Pten-null的腫瘤細胞增強了網膜內駐留樣巨噬細胞的積累

4. HMOX1^hi 巨噬細胞來源于腹腔液巨噬細胞

為了檢驗腹腔液駐留巨噬細胞是 HMOX1^hi 巨噬細胞的主要來源的假設，我們首先在 ID8細胞注射后24小時或13天將 AT CD45.1⁺ 腹腔液細胞(包括單核細胞，單核細胞來源的和駐留巨噬細胞)轉化為 CD45.2⁺ 小鼠。在網膜腫瘤中檢測到 CD45.1⁺ 細胞，證明腹腔液和腫瘤之間可以發生運輸(圖4A)。有趣的是，駐留的 CD45.1⁺ F4/80^hiMHCII^lo 細胞富含 Trp53^-/-; Pten^-/-腫瘤(圖4B 和 C，左) ，并相應地在腹水中耗盡(圖4B 和 C，中)。大多數 CD45.1⁺ 巨噬細胞是 TIM4⁺ ，表明長期居住(圖4B 和 C，右)。為了進一步確定 HMOX1^hi 巨噬細胞是否可以來源于腹腔液，我們將來自健康 HMOX1^GFP 小鼠的腹腔液 F4/80^hiCD102⁺ 細胞分選并將其 AT 到攜帶 Trp53^-/-; Pten^-/-腫瘤的 HMOX1^wt 同窩仔鼠中(圖4D)。我們在 Trp53^-/-; Pten^-/-網膜腫瘤(圖4E)中檢測到 HMOX1^GFP 細胞，其表型復制宿主自身的群體(CD11^c-MHCII^lo，CD102⁺ 精氨酸酶1+)并且幾乎完全來自長期駐留的 CD102⁺ TIM4⁺ 細胞(圖4F)。然而，宿主巨噬細胞庫中的一部分 CD102^-細胞具有高精氨酸酶1和 PD-L1表達(圖4G 和 H) ，表明一些簇2巨噬細胞也可能來源于非 CD102⁺ 腹膜液細胞。

Figure 4 HMOX1hi 巨噬細胞部分來源于腹腔液巨噬細胞

5. HMOX1抑制延長生存期

為了了解 HMOX1是否是 HGSC 潛在的治療靶點，我們使用了 HMOX1抑制劑中卟啉錫(SnMP; ref)。SnMP 處理不影響 MHCIIhiCD11c⁺ 單核細胞衍生的或 CD102⁺ F4/80^hi 巨噬細胞的網膜密度(圖5A 和 B) ，但確實增加了精氨酸酶1⁺ PD-L1⁺ HMOX1⁺ 巨噬細胞的密度(圖5C)。這可能是對 HMOX1抑制反應的補償機制，因為已知 SnMP 刺激 HMOX1上調，同時仍然阻斷酶活性。有趣的是，HMOX1抑制消耗了 LYVE1⁺ 巨噬細胞(圖5D) ，這表明它們對血紅素誘導的毒性敏感，與它們接近腫瘤脈管系統一致。SnMP 治療14天可減少腹水形成，但無顯著性差異(P = 0.078; 圖5E)。然而，延長的 SnMP 作為5天/2天休息制度給予，顯著增加了 Trp53^-/-; Pten^-/-荷瘤小鼠的存活(危險比0.32,95% CI，0.11-0.94，P = 0.002; 圖5F)。

Figure 5 HMOX1抑制延長攜帶 Pten-null ID8腫瘤的小鼠的存活

6. IL33作為簇2巨噬細胞的潛在驅動因素

為了確定 Pten-null腫瘤細胞如何驅動巨噬細胞擴增，我們最初篩選了趨化因子和細胞因子的表達。這表明在一些 Pten-null細胞中 Ccl2和 Ccl7的表達顯著增加，但不在另外缺乏 Brca2的細胞中。我們還分析了視黃酸產生酶 Raldh1,2和3的表達，因為腹膜和網膜駐留巨噬細胞由視黃酸支持，其驅動其駐留基因表達程序，包括 Gata6。然而，通過 Pten 缺失，Raldh1的表達并沒有持續改變。而 Raldh2和3在所有細胞中的表達可以忽略不計。此外，Trp53^-/-; Pten^-/-細胞沒有表現出增強的募集骨髓來源的巨噬細胞的能力，而 Ccr2的缺失導致骨髓來源的巨噬細胞向兩種基因型的募集減少。PTEN 缺失可以驅動前列腺癌中 IL6的產生。然而，在 Trp53^-/-; Pten^-/-ID8細胞(CT 值)中 Il6表達較弱，克隆之間沒有統計學差異，盡管 IL6蛋白不能被 ELISA 檢測到。編碼血管內皮生長因子的 Vegfa 也沒有受到 Pten 丟失的影響。綜上所述，這些數據表明，一個或多個超越 Ccl2和 Ccl7的因子在體內產生，支持駐地巨噬細胞的募集和擴張。簇2的基因特征使我們能夠進一步剖析 HMOX1^hi 巨噬細胞的潛在驅動因素。我們首先分析了 Trp53^-/-; Pten^-/-ID8細胞的大量 RNA-seq 分析。使用這種方法，我們發現與 Trp53^-/-ID8細胞相比，Trp53^-/-; Pten^-/-中有4,505個基因顯著上調(圖5G)。使用 IPA (圖5H) ，我們鑒定了簇2的25個潛在的上游調節因子，其中16個與 Pten 無效細胞中也上調的基因重疊(圖5I)。在這些基因中，我們將 Il33鑒定為刺激簇2基因表達的可能候選基因，因為它既是分泌因子，又預測激活簇2中最大的基因組之一(圖5J)。我們證實在 Pten 缺失的 ID8系中 Il33基因和 IL33蛋白表達增加(圖5K)。然后我們在 IL33存在下培養腹腔液駐留巨噬細胞，觀察到 Hmox1基因表達顯著增加(圖5L)。

7. 小鼠和人類 HMOX1hi 巨噬細胞具有共同的特征

為了確保我們的小鼠數據與 HGSC 患者相關，我們分析了一個大型 scRNA-seq 數據集，其中包含來自42名新診斷的初治 HGSC 患者的160個活組織檢查的數據。腫瘤相關巨噬細胞(n = 166,895)基于已知的標記基因(包括 PTPRC，CD14，FCER1G 和 CD68)進行注釋。我們首先根據 HMOX1表達對人巨噬細胞進行分類，將 HMOX1表達大于平均值1SD 的巨噬細胞定義為 HMOX1^hi (圖6A)。然后我們比較了 HMOX1hi 巨噬細胞和每個小鼠群的 DEG。簇2顯示 HMOX1^hi 細胞中重疊基因(n = 39)最多(圖6B)。同樣，在 HMOX1^hi 巨噬細胞的87 DEG 中，最高比例(44.8% ，n = 39/87) 與簇2共享。HMOX1^hi 巨噬細胞富含駐留巨噬細胞(LYVE1) ，血紅素代謝(BLVRB) ，細胞對缺氧(HILPDA) ，金屬硫蛋白(MT1E，MT1F，MT1G，MT1H 和 MT1M) ，鐵轉運蛋白，儲存和體內平衡(SLC40A1，HAMP，FTH1和 FTL)和脂質代謝和儲存(APOC1，PLIN2和 LIPA; 圖6C)。相反，HMOX1lo 巨噬細胞富含干擾素 γ 應答基因(CXCL9和 CXCL10) ，免疫細胞和 T 細胞募集基因(CCL5，CXCL9，CXCL10，CXCL11和 IL1B)和 MHCII 基因(HLA-DQA1; 圖6C)。對 HMOX1hi 巨噬細胞轉錄組的 MSigDB富集分析揭示了在小鼠簇2中也發現的缺氧反應，離子穩態，脂質代謝和 mTORC1信號傳導途徑的富集(圖6D)。因此，人類 HGSC 包含一組巨噬細胞，它們與小鼠簇2具有共同的特征，并且具有高 HMOX1表達、組織駐留、擁有屬性氧化應激反應和低促炎細胞因子/趨化因子表達。

Figure 6 小鼠和人 HMOX1hi 巨噬細胞在 HGSC 中具有共同的特征

8. HMOX1^hi 巨噬細胞與 HGSC 中 OS 和 PI3K 信號通路激活的關系

在小鼠中，簇2巨噬細胞幾乎只在 Pten-null腫瘤中發現(圖3A 和 B)。在 scRNA-seq 數據集中，來自富含 HMOX1^hi 巨噬細胞的腫瘤的癌細胞。S8A 表現出高 mTOR 信號傳導和高胰島素樣生長因子信號傳導(圖7A) ，可激活 PI3K/AKT 信號傳導。相比之下，HMOX1^hi 巨噬細胞富集的腫瘤中免疫相關通路下調(圖7A)。

在 BriTROC-1研究中，來自172名患者的診斷性 HGSC 樣品上的 IHC 表現出 HMOX1和 CD68之間的強相關性(圖7B 和 C) ，使我們能夠使用高 HMOX1表達作為 HMOX1^hi 巨噬細胞的替代物。HMOX1^hi 巨噬細胞的存在與腫瘤細胞中陽性 pAKT (S473)染色呈正相關，盡管很弱(圖7D 和 E)。S8B) ，并且在調整年齡和分期后也與 BriTROC-1患者的生存率降低獨立相關[ HR = 1.80(1.07-3.0) ; 圖7F 和 G ]。高 HMOX1表達對預后的影響在 mRNA 水平的單獨驗證隊列中得到證實。

Figure 7 高比例的 HMOX1^hi 巨噬細胞與較差的 OS 和 PI3K 信號通路激活有關

研究結論

總之，我們已經表明 HMOX1^hi 巨噬細胞具有常見的基因表達程序，包括免疫抑制，缺氧，膽固醇流出和脂質轉運，可以在小鼠和人類 HGSC 中鑒定。HMOX1^hi 巨噬細胞在 HGSC 中的功能仍有待充分了解，基因表達途徑可能反映了誘導 HMOX1^hi 細胞的 PI3K 驅動的微環境和整體巨噬細胞功能。盡管如此，我們的研究強調 HMOX1抑制可能為 HGSC 提供相關的治療策略。

研究方法：

細胞培養，RNA 提取和 cDNA 合成，SMART-Seq2 單細胞 RNA 測序，CD45.1 采血轉移，HMOX1^GFP 巨噬細胞采血轉移，腹腔常駐巨噬細胞體外刺激，單細胞 RNA 測序數據分析，ID8 批量 RNA 測序數據分析，HMOX1 在獨立驗證隊列中的診斷價值，統計分析。

參考文獻：

Spear S, Le Saux O, Mirza HB, Iyer N, Tyson K, Grundland Freile F, Walton JB, Woodman C, Jarvis S, Ennis DP, Aguirre Hernandez C, Xu Y, Spiliopoulou P, Brenton JD, Costa-Pereira AP, Cook DP, Vanderhyden BC, Keun HC, Triantafyllou E, Arnold JN, McNeish IA. PTEN Loss Shapes Macrophage Dynamics in High-Grade Serous Ovarian Carcinoma. Cancer Res. 2024 Nov 15;84(22):3772-3787. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-3890IF: 12.5 Q1 . PMID: 39186679IF: 12.5 Q1 ; PMCID: PMC7616669IF: 12.5 Q1 .