肝細胞癌（HCC）起源于慢性炎癥，肝星狀細胞（HSC）的激活通過形成促腫瘤微環境起作用。這個過程的關鍵是p62，它的失活導致肝癌的發生。在這里，作者發現p62通過促進HSC中STING泛素化（TRIM32）激活干擾素（IFN）級聯。p62是BRCA1基因1（NBR1）和STING的結合鄰居，通過取代NBR1觸發IFN級聯，而NBR1通常會阻止TRIM32與STING的相互作用及其隨后的激活。此外，NBR1還通過促進STING轉運到內溶酶體室進行獨立于自噬的降解來拮抗STING。與功能相關的是，NBR1缺失通過挽救被抑制的STING-IFN通路，完全恢復p62缺陷HSC的促瘤功能，從而增強CD8+ T細胞介導的抗腫瘤反應。因此，通過促進STING/IFN通路，NBR1作為HSC中p62缺乏的合成易感性出現，該通路可增強抗腫瘤CD8+ T細胞反應，從而抑制HCC進展。該文章于2024年10月發表在《Molecular cell》，IF：14.5。

摘要圖：

主要研究結果：

1. NBR1失活損害p62缺乏驅動的增強的肝臟腫瘤發生

由于p62的全身消融促進小鼠的肝癌發生，并且NBR1與p62相互作用，作者假設NBR1可能在p62缺乏增強體內肝臟腫瘤發生的能力中發揮作用。為了驗證這一假設，在2周齡時給NBR1 （NBR1 -/-）、p62 （Sqstm1-/-）或雙p62/NBR1 （Sqstm1-/- NBR1 -/-）的野生型（WT）和全身敲除型（KO）小鼠注射肝臟致癌物二乙基亞硝胺（DEN），并喂食高脂肪飲食（HFD）（圖1A），遵循有充分記錄的方案，在小鼠中誘導肝臟和腺瘤和HCC 與作者之前的觀察結果一致，通過肝體重比、腫瘤總數、大腫瘤數量（> 3mm）或Afp mRNA水平以及具有HCC組織學的腫瘤比例（圖1B-1G）來確定，16只p62缺陷小鼠與WT相比，腫瘤發生增加。雖然Nbr1-/-小鼠沒有表現出顯著的表型（圖1B-1G），但Sqstm1 -/-Nbr1-/-小鼠恢復了由p62缺失驅動的腫瘤進展增加（圖1B-1G和S1A）。這些發現表明，NBR1在由全身p62缺乏驅動的肝腫瘤惡性增強中起關鍵作用。由于Sqstm1-/-肝臟的致瘤前表型是由于產生了有利于HCC的TME，因此通過肝內注射將來自DEN + HFD處理小鼠的腫瘤的侵襲性同基因HCC細胞系（DihXD3）移植到WT、Sqstm1-/-、Nbr1-/-和Sqstm1-/-Nbr1-/-小鼠中（圖1H）。四周后，與Sqstm1-/-小鼠相比，DihXD3細胞在Sqstm1-/-小鼠肝臟中產生的原發性腫瘤更少（圖1I、1J和S1B），這表明NBR1的缺失逆轉了p62全身消融產生的致瘤性肝臟TME。基于作者之前的觀察，證實了HSC間室p62缺失是TME的一個重要因素，16作者假設NBR1缺失的影響也可能歸因于NBR1在HSC中以前未被認識到的作用。為了驗證這種可能性，將從WT、Sqstm1-/-、Nbr1-/-或Sqstm1-/- -Nbr1-/-小鼠中分離的造血干細胞與DihXD3細胞一起植入先前喂食HFD 2個月的WT小鼠肝臟中（圖1K）。與作者的假設一致，植入DihXD3 + Sqstm1-/- HSC的肝臟腫瘤比植入DihXD3 + WT HSC的肝臟腫瘤大，而植入DihXD3 + Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC的肝臟腫瘤發生減少（圖1L、1M）。與植入DihXD3 + WT HSC的肝臟相比，植入DihXD3 + Nbr1-/- HSC的肝臟腫瘤發生減少（圖1L、1M）。將DiHXD3細胞植入HSC中選擇性缺失NBR1的小鼠肝臟（Nbr1f/f; gmap - cre），與對照組（Nbr1f/f）小鼠相比，腫瘤負荷顯著降低（圖1N-1P）。這些結果表明，與p62相反，HSC中NBR1的缺乏會損害HCC的發展，并逆轉p62消融在HSC中的促瘤作用。

圖1 NBR1失活損害p62缺乏驅動的增強的肝臟腫瘤發生

2. NBR1和p62在造血干細胞中拮抗調節IFN通路

為了闡明NBR1和p62調控的信號通路，解釋它們在HCC中的不同作用，作者進行了基因集富集分析（GSEA）和基因集變異分析（GSVA），比較了WT、NBR1 -/-、Sqstm1-/-和Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC的轉錄組。作者發現，與WT型HSC相比，Nbr1-/-中與IFN通路激活相關的信號顯著上調，這些信號在Sqstm1-/- HSC中被抑制，在Sqstm1-/-Nbr1-/- HSC中恢復（圖2A-2C）。這些觀察結果通過幾個IFN刺激基因的qPCR進一步驗證（圖2D）。免疫組織化學分析顯示，在同時缺失Nbr1的Sqstm1-/- HSC的肝臟中，pSTAT1 （IFN激活的一個指標）減少（圖2E-2G）。在共移植或內源性HSC特異性小鼠模型中，Nbr1的缺失足以釋放IFN的高pSTAT1染色（圖2E-2J）。與HSC中p62或NBR1缺失導致的IFN通路的相反調控一致，作者發現Sqstm1-/- HSC模型的肝腫瘤中CD8+ T細胞缺失，NBR1缺失能夠通過促進CD8+ T細胞浸潤增加來挽救這種表型（圖2E-2J）。

圖2 NBR1和p62在造血干細胞中拮抗調節干擾素通路

3. HSCs中NBR1缺失產生的腫瘤保護反應是由CD8+ T細胞介導的

與CD8+ T細胞和IFN反應是TME中關鍵的抗癌元件一致，中和了抗CD8抗體，有效地消耗了大約90%的腫瘤浸潤性CD8+ T細胞，恢復了由Sqstm1-/- NBR1 -/- HSCs存在引起的腫瘤發展抑制（圖2K和2L）。腫瘤體積明顯增大（圖2M），抗cd8處理小鼠均出現肺轉移（圖2N、圖2O）。流式細胞術和轉錄分析顯示，CD8+ T細胞的缺失完全恢復了Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC產生的IFN相關免疫反應（圖2P和2Q）。這種反應與免疫抑制細胞或其他免疫細胞群的募集無關。這些結果表明，p62缺陷造血干細胞中NBR1的缺失誘導了依賴于IFN級聯的CD8+ T細胞介導的抗腫瘤反應。

圖3 STING對造血干細胞中NBR1缺失的抗腫瘤活性至關重要

4. NBR1和p62對STING介導的IFN通路具有相反的調控作用

激活IFN通路的兩種主要機制包括cGAS/STING和RIG-I/MAVS級聯，它們分別是由細胞質中雙鏈DNA （dsDNA）或雙鏈RNA （dsRNA）的存在誘導的為了研究這兩種信號通路對NBR1缺失驅動的表型的貢獻，作者分別通過敲除Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC中的STING （Tmem173基因）或MAVS來靶向這兩種機制。敲低STING可降低Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC中pSTAT1和STAT1水平，并降低ifn相關基因的表達，而敲低MAVS則無影響（圖3A和3B）。通過干擾素調節因子3 （IRF3）的磷酸化確定，用dsDNA處理不同基因型的HSC導致STING信號級聯的更強激活，與WT HSC相比，Nbr1-/和Nbr1-/-Sqstm1-/- HSC中干擾素調節因子3 （IRF3）的磷酸化在Sqstm1-/- HSC中顯著降低（圖3C和3D）。代表性ifn應答基因在Nbr1-/和Nbr1-/-Sqstm1-/- HSC中表達增強，但在Sqstm1-/- HSC中表達受損（圖3E）。用環GMP-AMP （cGAMP）刺激，一種直接的STING激動劑，復制了Nbr1-/- HSC中IFN激活的增強和Sqstm1-/- HSC中IFN信號的受損（圖S3A和S3B），證明了Nbr1和p62對STING的直接作用獨立于cGAS。與WT型HSC相比，Nbr1-/和Nbr1-/-Sqstm1-/- HSC顯示未磷酸化和磷酸化的STING水平升高，而Sqstm1-/- HSC則沒有（圖3C和3F）。體內內源性Nbr1缺失后，造血干細胞中STING水平也升高（圖3G-3I）。這些結果表明，盡管NBR1和p62通過STING拮抗IFN通路，但它們可能利用不同的機制。與此一致的是，NBR1過表達（NBR1 OV細胞）導致STING水平降低和IFN激活降低，而p62過表達（p62 OV細胞）增強了IFN通路的激活，但不改變STING含量。這表明雖然NBR1通過調節STING水平影響IFN通路，但p62使用不同的機制。

5. STING對造血干細胞中NBR1缺失的抗腫瘤活性至關重要

基于這些結果，作者假設Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC的致瘤活性降低可能與STING介導的IFN級聯上調有關。在Sqstm1-/- NBR1 -/- HSC中，STING的敲低會損害pSTAT1的激活和Ifnb的表達。將STING缺陷HSC與DihXD3細胞共植入hfd喂養的WT小鼠的肝臟，在p62失活的情況下，NBR1缺陷的腫瘤抑制活性得以恢復（圖3J – 3O）。這種被拯救的表型包括肺轉移發生率的增加，其程度與Sqstm1-/- shNT細胞相當（圖3N和3O）。流式細胞術分析CD45+浸潤細胞的結果顯示，DihXD3與Sqstm1-/- NBR1 -/- shNT共植入造血干細胞時，IFNg的產生比與Sqstm1-/- shNT共植入造血干細胞時更多，以CD8+ T細胞為主，CD4+ T細胞較少（圖3P）。與這種增強的IFN反應一致，與Sqstm1-/- NBR1 -/- shNT細胞相比，Sqstm1-/- shNT造血干細胞顯著增加了巨噬細胞表面主要組織相容性鏈II （MHCII）的表達，以及表達程序性死亡配體1（PD-L1）的非免疫細胞的百分比（圖3Q）。在Sqstm1-/- NBR1 -/- shNT造血干細胞形成的腫瘤中，幾個IFN相關基因也有所增加（圖3R）。這些結果表明，p62缺陷造血干細胞中NBR1的缺失通過STING/ IFN依賴機制促進抗腫瘤免疫反應。

圖4 NBR1而非p62通過控制其從高爾基體到溶酶體的運輸來調節STING蛋白水平

6. NBR1而非p62通過溶酶體運輸調節基礎STING水平

作者的研究結果表明，Nbr1-/- HSC，而不是Sqstm1-/- HSC，具有更高的基礎STING水平，并且Nbr1的過表達，而不是p62，誘導STING蛋白量的減少，獨立于轉錄（圖4A和4B）。因此，作者假設NBR1在介導STING蛋白水解中具有潛在的選擇性作用。為了確定NBR1誘導STING降解的主要途徑，作者用蛋白酶體（MG132）或溶酶體（巴菲霉素A1 [BafA1]）抑制劑處理NBR1過表達（OV）和對照空載體（EV）造血干細胞。BafA1而不是MG132可以抑制NBR1誘導的STING降解（圖4C）。BafA1處理不僅阻斷了STING降解，還恢復了NBR1 OV細胞中pIRF3的激活（圖4D），支持STING溶酶體降解在NBR1控制IFN通路中的重要性。

圖5 NBR1和p62的競爭性結合調控STING信號傳導

貨物可以通過三種主要的降解途徑遞送到溶酶體：巨噬、內體微自噬和伴侶介導的自噬（CMA）。為了確定這些機制對NBR1誘導的溶酶體介導的STING降解的貢獻，作者使用特定的小干擾RNA （siRNA）選擇性地靶向每個途徑的關鍵組分：Atg5（大自噬）、Lamp2a （CMA）、Tsg101（運輸所需的內體分選復合體[ESCRT]/內體微自噬）和Rab7（參與從內體到溶酶體運輸的GTPase）。雖然Atg5或Lamp2a的敲低并不影響NBR1誘導的STING降解，但Tsg101或Rab7的敲低顯著消除了這種影響（圖4E和4F），這表明NBR1促進STING降解的機制主要涉及escrt依賴性溶酶體途徑。這些結果與先前的報告一致，表明STING水平主要由escrt驅動的微自噬途徑控制。

根據該模型，cGAMP與STING結合觸發其從內質網（ER）向順高爾基體、反式高爾基網絡和核內體的易位。一旦STING到達核內體，它通過ESCRT內化成多泡體（MVBs）。rab7介導的MVBs與溶酶體融合后，STING在酸化的溶酶體環境中被降解（圖4G）。接下來，作者確定了NBR1是否在IFN通路激活期間調節STING從內質網到內溶酶體的運輸。NBR1或p62基因失活不影響cgamp觸發的STING從內質網到高爾基體的轉運（圖4H）。然而，NBR1缺乏癥阻礙了STING從高爾基體的出口，導致其長時間滯留在這個細胞隔室中（圖4H）。STING在高爾基體停留時間的延長可能促進了TANK結合激酶1（TBK1）和IRF3的募集和磷酸化，從而促進了NBR1缺陷造血干細胞中IFN信號的增強。一致地，作者發現STING向反式高爾基網絡（圖4I）以及其他后高爾基區室（如晚期核內體（圖4J）和rab7陽性區室（圖4K）的進展延遲，這也解釋了NBR1缺失的HSC中STING降解的減少。相比之下，p62缺失并不影響STING從內質網向不同細胞區室的運輸（圖4H-4K），這與p62缺失不改變STING水平的事實是一致的（圖4A和4B）。因此，這些結果表明，NBR1驅動STING及時從高爾基體中退出，確保了基礎STING的適當穩態降解（圖4L）。

7. NBR1和p62的競爭性結合調控STING信號傳導

考慮到p62和NBR1在STING介導的IFN通路中的拮抗作用，以及p62不會改變STING的基礎水平，作者接下來研究了它們在調節STING信號傳導中的潛在作用。在過表達蛋白的共免疫沉淀實驗中，NBR1和p62與STING相互作用。在基礎條件下，NBR1與STING的結合強于p62。然而，cGAMP刺激在p62募集的同時促進了NBR1與STING的分離，其動力學與IFN通路激活的動力學一致。在造血干細胞中，內源性蛋白的免疫沉淀（圖5A和5B）、免疫熒光實驗中的共定位（圖5C和5D）以及鄰近結聯實驗（圖5E和5F）也觀察到了NBR1和p62與STING在cGAMP刺激下的動態相互作用。這些實驗表明，NBR1在基礎條件下與STING結合，但在cGAMP刺激下釋放。相比之下，cGAMP促進p62與STING的結合。與該模型一致，NBR1在內質網與STING共定位，而cGAMP刺激后在ESCRT檢測到p62-STING共定位，分別用ER和ESCRT的標志物Calnexin和HGS進行免疫熒光檢測。這表明p62和NBR1與STING的相互作用可能是互斥的。事實上，共轉染實驗表明，p62過表達破壞了基礎NBR1-STING復合物的形成（圖5G），這表明p62和NBR1在與STING相互作用方面存在競爭。與該模型一致，p62缺陷導致NBR1與STING的組成性結合，這與IFN激活的損傷相關（圖5H）。通過共免疫沉淀實驗和免疫熒光共定位檢測，cGAMP刺激觸發了時間依賴性的NBR1-p62相互作用（圖5I和5J）。由于它們各自的PB1結構域介導p62和NBR1的相互作用，作者突變了p62的PB1結構域（K7A）和NBR1的PB1結構域（D50R），并證明它破壞了它們與STING的相互作用。然而，刪除泛素相關（UBA）結構域或其他結構域并不影響這些相互作用。這些結果支持了一個模型，即NBR1與STING的結合被p62的誘導募集破壞，p62取代了NBR1（圖5K）。與此一致的是，順序共免疫沉淀實驗顯示，在cGAMP刺激下，p62、NBR1和STING沒有三聚體復合物，與STING結合的p62復合物不包括NBR1（圖5L）。

8. NBR1和p62在STING寡聚化中的相反作用

作圖實驗表明，STING的二聚化結構域都需要與NBR1和p62結合（圖5M）。在cGAMP刺激下，p62的缺失會破壞STING寡聚化，而Nbr1-/- HSC在基礎和刺激條件下顯示出增加的STING寡聚化（圖5N和5O）。由于STING的二聚化對其激活至關重要，31這些結果與Nbr1-/和Sqstm1-/- HSC在STING信號傳導上的相反表型一致。與此相一致的是，位于STING二聚體界面（人類STING中為N154S，小鼠STING中為N153S）的與嬰兒期起病的STING相關的血管病變（SAVI）患者相關的功能獲得突變降低了STING與NBR1的結合（圖5P）。這些結果支持NBR1在STING介導的IFN信號傳導中的負作用，通過控制STING基礎水平并阻止其在cGAMP刺激下的激活和寡聚化，而p62在cGAMP刺激下取代NBR1并促進STING寡聚化及其激活。

圖6 NBR1和p62通過TRIM32調控STING泛素化

9. NBR1和p62通過TRIM32調控STING泛素化

鑒于泛素化在STING激活中的關鍵作用，作者接下來研究了NBR1和p62對其的潛在調控。與之前的報道一致，cGAMP刺激促進了STING的泛素化，在Nbr1-/中增強，而在Sqstm1-/- HSC中降低，同時激活了pIRF3（圖6A）。一致地，NBR1的過表達抑制了STING泛素化，而p62的過表達促進了STING泛素化（圖6B）。STING在k63鏈中泛素化。以NBR1為誘餌，通過鄰近依賴生物素化試驗（BioID2）進行無偏篩選，發現E3泛素連接酶三方基序蛋白（TRIM32）是NBR1的相互作用伙伴（圖6C）。這在異位表達HEK293細胞的共免疫沉淀實驗和造血干細胞的內源性免疫沉淀實驗中得到證實，表明TRIM32通過其UBA結構域優先結合NBR1而不是p62（圖6D）。Trim32敲低抑制了NBR1缺陷細胞中增強的STING泛素化和IFN信號傳導（圖6E和6F），證明了NBR1-TRIM32相互作用的功能相關性。TRIM32缺失嚴重損害了p62 OV細胞中增強的pIRF3誘導（圖6G）。TRIM32-缺陷細胞沒有顯示出STING含量的改變（圖6F和6G），表明TRIM32不控制STING降解，這與TRIM32促進k63泛素化這一通常不是降解信號的事實一致。與此一致的是，TRIM32敲低后，STING的溶酶體運輸沒有變化。TRIM32水平在NBR1缺陷細胞中上調，這表明，與STING的情況一樣，NBR1也控制著TRIM32的穩態基礎水平（圖6E和6F）。這些發現確立了TRIM32在NBR1和p62拮抗調節STING介導的IFN信號傳導機制中的關鍵作用。

先前的數據表明，TRIM32介導的STING泛素化促進了TBK1-STING相互作用，這是STING介導的IFN激活的關鍵步驟與NBR1和p62對STING泛素化的相反作用一致，NBR1的缺失增加，p62的缺失損害了TBK1與STING的結合（圖6H和6I）。通過繪制TRIM32誘導的STING泛素化位點，很明顯，STING泛素化缺陷突變體不與TBK1相互作用，但對其與NBR1或p62的相互作用沒有影響。另一方面，在Nbr1-/-細胞中觀察到的STING- tbk1相互作用增強與TRIM32向STING募集增加相關，而在Sqstm1-/-細胞中則受損，這表明p62通過與TRIM32相互作用促進STING泛素化的關鍵作用，即使在Nbr1缺失的HSC中，TRIM32也不直接與p62相互作用（圖6D）。

作者的數據預測NBR1阻止TRIM32促進STING泛素化。cGAMP刺激使NBR1與TRIM32分離，這一事實支持了這一觀點（圖6J-6L）。與作者的假設一致，NBR1過表達破壞了TRIM32與STING之間的相互作用（圖6M），表明NBR1負調控TRIM32-STING復合物的形成，阻礙了STING泛素化。p62的逐漸募集導致NBR1與STING的分離，促進了TRIM32隨后與STING的關聯（圖6N），從而啟動了IFN通路的激活。這些結果表明，NBR1和p62在IFN級聯中的相反作用是通過它們影響TRIM32誘導的STING泛素化的能力介導的，這是TBK1募集和IFN信號激活的關鍵事件（圖6O）。

圖7 在HCC進展過程中，NBR1在HSC中上調，并與低STING水平相關

10. 在HCC進展過程中，NBR1在HSC中上調，并與低STING水平相關

為了支持作者研究結果的生理學相關性，作者首先評估了HCC進展過程中HSCs中p62和NBR1的表達。作者用OPAL-multiplex法對來自正常肝臟、MASH和HCC的人類臨床標本進行p62、NBR1和aSMA染色。與作者之前發表的數據一致，與正常肝臟相比，MASH和HCC樣本中HSC中的16p62水平降低（圖7A和7B）。相比之下，HSCs中的NBR1表達在從正常肝臟到MASH的過渡過程中逐漸增加，并在HCC中進一步增加（圖7A和7B）。在兩種體內損傷/纖維化小鼠模型中，HSCs中的NBR1水平一致地顯著升高。

為了驗證p62和NBR1在人類標本中IFN通路中的相反作用，作者首先查詢了公開可用的單細胞RNA測序（RNA-seq）數據集，其中包括來自健康供體和HCC患者的HSC。來自腫瘤樣本的造血干細胞被標記為癌癥相關成纖維細胞（CAFs），根據NBR1和SQSTM1的表達進行分類。該分析顯示，在NBR1低表達的HSC中，IFN應答特征顯著富集，而在SQSTM1低表達的HSC中，IFN應答特征顯著減少（圖S7C-S7N）。這些數據支持NBR1和p62在調節人類HSC中IFN信號通路中的相反作用。為了進一步驗證NBR1在人類HCC中作為STING負調節因子的作用，作者使用OPAL-multiplex分析了大量手術切除的HCC標本。在組織微陣列（TMA）的287個樣本中，根據aSMA+細胞中NBR1的表達水平對200個樣本進行分層（圖7C和7D）。偶然性分析顯示，與NBR1陰性染色的HCC患者相比，HSCs中可檢測到NBR1表達的HCC患者的STING陰性/低發生率更高（圖7E和7F）。與此一致的是，多變量logistic回歸分析表明，HSCs中NBR1陽性表達與STING低水平相關，獨立于其他病理特征（圖7G），表明NBR1在HCC人類腫瘤中調節IFN信號通路中起主要作用。多變量logistic回歸分析還表明，HSCs中NBR1的表達是低分化HCC的重要預測因子（圖7G），這表明HSCs中NBR1的表達對于產生免疫抑制微環境至關重要，該微環境通過STING-IFN級聯驅動。

結論：

作者之前報道過p62的缺失破壞了一種機制，該機制通過維生素D受體（VDR）級聯的持續激活來維持造血干細胞處于靜止、未分化狀態因此，p62的缺失驅動造血干細胞向肌成纖維細胞的分化，這是導致肝癌的促炎和纖維化微環境的原因。這些先前的數據和本文報道的數據提出了p62在肝臟炎癥中起雙重作用的模型。p62通過VDR級聯阻止HSC的活化，并通過STING控制NBR1拮抗的免疫監視。作者的數據支持旨在消耗NBR1或損害其與STING相互作用的策略，以促進CD8+驅動的免疫療法在p62水平降低的HCC腫瘤中。

實驗方法：

細胞培養實驗、流式細胞術分析、組織學、免疫組織化學和免疫熒光、組織微陣列分析、原位接近結扎試驗、免疫印跡和免疫沉淀試驗、基于bioid2的篩選、基于bioid2篩選的LC-MS/MS分析、BioID數據分析、基因表達分析、生物信息學分析

參考文獻：

Nishimura, S., Linares, J. F., L'Hermitte, A., Duran, A., Cid-Diaz, T., Martinez-Ordo?ez, A., Ruiz-Martinez, M., Kudo, Y., Marzio, A., Heikenwalder, M., Roberts, L. R., Diaz-Meco, M. T., & Moscat, J. (2024). Opposing regulation of the STING pathway in hepatic stellate cells by NBR1 and p62 determines the progression of hepatocellular carcinoma. Molecular cell, S1097-2765(24)00782-2. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.09.026