索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，在包括胃癌（GC）在內的多種癌癥中作為鐵死亡誘導劑具有重要的抗腫瘤作用。然而，最近索拉非尼作為鐵死亡誘導劑的狀態受到質疑。關于鐵死亡和ATF2之間關系的信息非常有限，且ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用尚未被研究。在本文中，作者探討了GC中ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用及其相關分子機制。本文于2023年1月發表在《Redox Biology》IF:11.4期刊上。

技術路線

主要實驗結果
1、ATF2在胃癌中表達上調并預示不良預后
       TCGA數據庫顯示與正常組比較，ATF2 mRNA表達在腫瘤中顯著上調（圖1A）。此外，與正常細胞系GES-1比較，GC細胞系中ATF2的蛋白表達顯著上調（圖1B），該結果被臨床12對癌與癌旁的檢測結果所驗證（圖1C）。使用IHC檢測了107例GC組和22例正常組織中ATF2的表達，代表性圖像見圖1D，結果發現GC組織中61.7%的樣本ATF2高表達，而癌旁中63.6%的樣本ATF2低表達（圖1E）。結合患者預后的生存分析顯示ATF2高表達組的總體生存期顯著下降（圖1F）。KM數據庫得出了類似的結論（圖1G）。總之，ATF2在GC中表達上調并預示不良預后。

圖1 ATF2在GO中上調且預測不良預后

2、ATF2促進GC細胞惡性表型
       如圖2所示，在GC細胞中敲低ATF2后顯著抑制細胞的增殖遷移和侵襲，過表達ATF2則相反，表明ATF2促進GC細胞惡性表型。

圖2 ATF2敲低抑制GC細胞惡性表型

3、索拉非尼誘導GC細胞鐵死亡
       由于先前的研究表明索拉非尼誘導鐵死亡的不確定性，作者首先探究了索拉菲尼是否誘導GC細胞鐵死亡。如圖3A所示，索拉菲尼處理細胞24h后，AGS和MGC-803細胞形態呈現出收縮，變圓，排列松散，而同時使用鐵死亡抑制劑Fer-1處理則可反轉這種效果。與對照組相比，索拉非尼處理導致總細胞ROS和脂質ROS均顯著增加（圖3B-C），并且導致MDA水平增加（圖3D），GSH水平下降（圖3E），然而Fer-1處理抑制上述效果。

圖3 索拉非尼誘導AGS和MGC-803細胞鐵死亡

       鑒于鐵死亡與線粒體功能息息相關，因此，作者進一步檢測了索拉菲尼對MMP和線粒體形態的影響。JC-1染色結果顯示，與對照組比較，索拉菲尼顯著減低AGS和MGC-803細胞MMP（圖4A）。此外，TEM顯示索拉菲尼處理的MGC803細胞線粒體嵴明顯減少或缺失，線粒體膜密度增加（圖4B）。這些結果表明索拉非尼可以誘導GC細胞的鐵死亡。
       作為一種關鍵的應激反應轉錄因子，ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的表達變化尚不清楚。如圖4C所示，索拉非尼處理增加ATF2的表達，尤其是磷酸化形式。免疫熒光顯示，索拉非尼刺激后ATF2在細胞核中的表達更高（圖4D）。因此，索拉非尼誘導的鐵死亡可能會促進ATF2的核轉位并增強ATF2在GC細胞中的轉錄活性。

圖4 索拉非尼處理增加GC細胞中ATF2的表達并促進其核易位

4、ATF2敲低抑制索拉菲尼誘導的GC細胞鐵死亡
       如圖5A所示，敲低ATF2導致GC細胞的IC50下降，過表達則相反。此外，索拉菲尼和ATF2敲低均顯著增加細胞內總ROS和脂質ROS含量，而兩者同時進行則進一步促進其增加，但是，索拉菲尼處理同時過表達ATF2則顯著回落ROS的水平（圖5B-C）。類似的，過表達ATF2可顯著逆轉因索拉菲尼處理引起的MDA增加（圖5D）和GSH下降（圖5E），以及線粒體形態改變（圖5F）。這些發現表明ATF2過表達抑制索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡。

圖5 ATF2敲低抑制索拉菲尼誘導的GC細胞鐵死亡

5、ATF2在GC細胞中激活HSPH1的轉錄
       為進一步闡明ATF2的潛在機制，進行RNA-seq和ChIP-seq分析，以鑒定ATF2的全基因組DNA結合位點和潛在轉錄靶點。如圖6A所示，RNA-seq分析顯示，與對照組相比，MGC803細胞中ATF2敲除后，1059個基因上調，370個基因下調。重要的是，RNA-seq數據的通路富集分析表明，ATF2敲除明顯影響鐵死亡通路（圖6B）。ChIP-seq共鑒定出24119個峰，對應3641個RefSeq基因，其中2.88%位于啟動子-轉錄起始位點（圖6C）。在染色體上觀察到了不同的峰值，并掃描了峰值之間共享的motifs（圖6D和E）。

圖6 RNA-seq和ChIP-seq鑒定ATF2的全基因組DNA結合位點和轉錄靶點

       然后對RNA-seq和ChIP-seq數據進行交叉分析，篩選出222個受ATF2直接調控的候選轉錄靶標（圖7A）。其中，HSPH1在ATF2敲除后顯著下調（圖7B）。此外，在TCGA數據集中，HSPH1在GC中的表達與ATF2呈顯著正相關（圖7C）。如圖7D所示，ChIP-seq數據顯示在HSPH1的啟動子區域有明顯的ATF2結合峰。因此，推測HSPH1可能是ATF2的潛在靶基因。WB分析結果顯示，HSPH1在ATF2過表達后增加，而在ATF2敲除后減少（圖7E）。此外，ChIP-qPCR進一步證實ATF2可以結合到HSPH1的啟動子區域（圖7F）。這些數據表明ATF2可以通過與HSPH1啟動子結合來激活HSPH1的表達。

圖7 ATF2與HSPH1啟動子結合激活其轉錄

6、HSPH1與SLC7A11結合并增加其穩定性
       鑒于一些研究報道了HSP蛋白在鐵死亡中的突出作用，作者試圖確定HSPH1是否可能影響SLC7A11在GC中的表達。首先查詢了GeneMANIA數據庫，其預測并顯示了HSPH1和SLC7A11之間潛在的相互作用（圖8A）。為驗證這一預測，進行co-IP實驗，確定HSPH1與SLC7A11存在物理相互作用（圖8B）。接下來，采用siRNA敲除HSPH1的表達（圖8C），并將HSPH1 siRNA轉染到ATF2穩定過表達的AGS細胞中。觀察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表達水平，但沒有降低mRNA水平（圖8D）。因此，進行了CHX試驗，以確定在HSPH1敲除或未敲除的情況下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明，與對照組相比，抑制HSPH1加速了AGS細胞中SLC7A11蛋白的降解（圖8E）。這些結果表明，HSPH1可以與SLC7A11相互作用，并至少部分地通過增加SLC7A11蛋白的穩定性來增加其表達。
       敲除HSPH1可以部分消除ATF2過表達對細胞ROS和脂質ROS的影響（圖8F和G）。同樣，與HSPH1 siRNA共轉染可顯著逆轉ATF2過表達對鐵死亡細胞MDA和GSH水平的影響（圖8H和I）。這些結果為ATF2通過HSPH1調控索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡提供了證據。

圖8 HSPH1與SLC7A11結合并增加其穩定性

7、ATF2敲低增加小鼠GC腫瘤對索拉菲尼的敏感性
       最后，為評估ATF2單獨敲除和與索拉非尼聯合敲除對體內GC的影響，建立了裸鼠異種移植模型（圖9A）。與對照組相比，穩定敲除ATF2細胞形成的腫瘤體積更小，重量更輕，表明ATF2敲除可以有效抑制體內腫瘤的生長（圖9B）。此外，索拉非尼治療后，皮下腫瘤的體積和重量均顯著進一步下降（圖9C和D）。表明ATF2敲除聯合索拉非尼治療對腫瘤生長的抑制作用最強。為更好地觀察潛在的鐵死亡，皮下腫瘤切片被4-HNE染色，4-HNE是一種敏感的脂質過氧化標記物。IHC染色顯示sh-ATF2+索拉非尼組4-HNE表達最高（圖9E）。因此，ATF2敲除可增強索拉非尼對體內GC的抗腫瘤作用。

圖9 ATF2敲低增加小鼠GC腫瘤對索拉菲尼的敏感性

       總之，作者發現索拉非尼激活ATF2的表達，并進一步促進HSPH1的表達，減少SLC7A11蛋白的降解，從而導致了對脂質過氧化的保護（圖10）。因此，以ATF2/HSPH1軸為靶點增強索拉非尼誘導的鐵變態反應是一種有吸引力的GC治療策略。

圖10 圖像摘要

實驗方法
臨床收集福爾馬林固定石蠟包埋的GC樣本，細胞培養，WB，qRT?PCR，免疫組織化學染色，細胞增殖曲線，半數抑制濃度（IC50）實驗，Transwell遷移和侵襲實驗，Calcein-AM/PI染色，細胞內ROS和脂質過氧化檢測，MDA和GSH檢測，線粒體膜電位（MMP）檢測，透射電鏡實驗（TEM），RNA測序，染色質免疫共沉淀（ChIP）測序，ChIP-qPCR，co-IP，蛋白質穩定性實驗，小鼠腫瘤模型
參考文獻
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59: 102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564. 

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