射頻熱消融是治療肝細胞癌（HCC）的理想根治方法。然而，不充分的射頻消融（IRFA）可能會導致肝癌的高復發(fā)率。在哺乳動物和酵母中，tRNA上的N7 -甲基鳥苷（m7G）是一種進化上保守的修飾，可調(diào)節(jié)熱應激反應和腫瘤進展，但它在IRFA后HCC復發(fā)中的功能仍不清楚。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)METTL1 介導的 m7G tRNA修飾在體外和體內(nèi)亞致死熱應激下促進HCC轉(zhuǎn)移。機制上，METTL1介導的m7G tRNA修飾以依賴于密碼子頻率的方式選擇性調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中關(guān)鍵基因SLUG/SNAIL的翻譯。該研究于2023年6月發(fā)表在《Molecular Therapy》，IF：12.4。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. HCC中亞致死熱應激促進METTL1表達和m7 G修飾
       建立IRFA或HCC患者異種移植（PDX）小鼠模型，以高精度模擬臨床HCC 消融。使用紅外成像儀監(jiān)測腫瘤過渡區(qū)（TZ）在41℃-50℃范圍內(nèi)遭受亞致死性熱應激時的溫度（圖1A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IRFA 顯著上調(diào)了TZ中m7G tRNA 修飾水平以及METTL1和WDR4的表達（圖1B-1D）。METTL1 和 WDR4 在非腫瘤組織中的水平較低，但在RFA治療后復發(fā)的HCC組織中的水平顯著升高（圖1E和1F）。亞致死性熱處理可顯著上調(diào)HCC患者衍生的類器官組織中METTL1 和WDR4的表達（圖1G和1H）。在亞致死熱應激HCC細胞模型中驗證亞致死熱處理會增加HCC細胞中m7G tRNA的修飾及METTL1/WDR4 的水平（圖1I和1J）。這些數(shù)據(jù)表明，IRFA誘導的m7G tRNA 修飾上調(diào)可能與HCC在RFA 期間的耐熱性有關(guān)。

圖1. 暴露于亞致死熱應激下的HCC中m7G tRNA修飾和METTL1/WDR4水平升高

2. 敲降METTL1抑制亞致死熱應激下HCC細胞的惡性行為
       鑒于亞致死熱應激會增加m7G tRNA的修飾和METTL1/WDR4的表達，作者推測METTL1 可能在亞致死熱應激下發(fā)揮重要的致癌功能。northwestern blot（圖2A）證明METTL1 基因敲低降低tRNA的m7G修飾。亞致死熱應激顯著抑制HCC細胞的生長（圖2B）、克隆形成能力（圖2C、2D）和細胞周期進展（圖2E），而 METTL1 的缺失進一步抑制亞致死熱處理下HCC細胞的生長和克隆形成。另一方面，亞致死熱應激會誘導HCC細胞凋亡，當 METTL1 被沉默時，這一趨勢更加明顯（圖2F）。此外，亞致死熱處理顯著促進三種HCC細胞的遷移和侵襲能力，但METTL1沉默會顯著削弱這一趨勢（圖2G-2J）。這些數(shù)據(jù)表明，METTL1 在亞致死熱應激下對HCC的惡性特征起著重要作用。

圖2. 敲低METTL1抑制亞致死熱應激下HCC細胞的惡性行為

3. 過表達METTL1以m7G tRNA 修飾依賴的方式促進HCC細胞在亞致死熱應激后的惡性能力
       在HCC細胞中過表達野生型（oeWT）及其無催化活性突變體（oeMUT）METTL1。與oeNC 相比，在含有oeWT METTL1 而非oeMUT METTL1的HCC 細胞中觀察到tRNA 中m7G修飾水平增加（圖3A）。在正常培養(yǎng)條件下，oeWT METTL1 顯著促進HCC細胞生長（圖3B）、克隆形成（圖3C、3D）、遷移（圖3E、3F）和侵襲（圖3G、3H）。然而，過表達無催化活性突變體METTL1 對HCC的進展影響甚微（圖3B-3H）。同樣，在亞致死熱處理條件下，過表達 WT METTL1 而非突變體METTL1顯著促進HCC細胞的惡性發(fā)展（圖3B-3H）。這些數(shù)據(jù)表明，在亞致死性熱應激下，METTL1以m7G tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性依賴的方式對HCC細胞惡性化至關(guān)重要。

圖3. 過表達METTL1以m7G tRNA 修飾依賴的方式促進HCC細胞在亞致死熱應激后的惡性能力

4. 亞致死熱應激通過METTL1-m7G 介導的翻譯控制機制提高HCC細胞的惡性潛能
       TRAC-seq結(jié)果顯示，亞致死熱處理后，HCC細胞中的tRNA m7G修飾顯著上調(diào)（圖4A、4B）。此外，大多數(shù)經(jīng)m7G修飾的tRNA的表達水平在亞致死熱處理后也有所提高，尤其是ThrTGT和LysCTT tRNA（圖4C）。翻譯預測進一步發(fā)現(xiàn)，亞致死熱應激后，關(guān)鍵EMT 基因SLUG和SNAIL的翻譯效率顯著增加，而敲除METTL1會減少熱處理HCC細胞中這兩個基因的mRNA翻譯（圖4D 和4E）。消耗METTL1會顯著降低SLUG 和SNAIL 的蛋白水平和mRNA 翻譯效率，這表明METTL1 促進熱處理HCC細胞中SLUG和SNAIL mRNA的翻譯（圖4F、4G）。此外，tRNA LysCTT在熱處理后顯著增加（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，m7G tRNA，特別是tRNA LysCTT，以依賴于密碼子頻率的方式調(diào)節(jié)SLUG 和SNAIL的翻譯。因此，作者進行LysCTT挽救實驗，發(fā)現(xiàn)在缺失METTL1 的細胞中過表達LysCTT可在熱致死性應激后挽救SLUG 和SNAIL 的蛋白水平（圖4H），從而加強METTL1介導的tRNA m7G修飾與SLUG和SNAIL mRNA 翻譯之間的功能聯(lián)系。

圖4. 亞致死熱應激以m7G tRNA密碼子頻率依賴的方式提高SLUG/SNAIL的翻譯效率

5. SLUG/SNAIL異位表達挽救亞致死性熱應激下METTL1 敲低的 HCC 細胞的惡性能力
       在METTL1穩(wěn)定敲除的HCC細胞中過表達SLUG/SNAIL進行挽救試驗（圖5A）。數(shù)據(jù)顯示，在亞致死性熱應激下，過表達SLUG或SNAIL能顯著促進METTL1敲除HCC細胞的生長和菌落形成（圖5B-5D）。此外，在過表達SLUG/SNAIL后，METTL1敲除的HCC細胞的遷移和侵襲能力得到恢復（圖5E-5H）。因此，SLUG/SNAIL是METTL1的重要下游靶標，在亞致死性熱應激下提高HCC細胞的惡性潛能。

圖5. SLUG/SNAIL異位表達挽救亞致死性熱應激下METTL1敲低的HCC細胞的惡性能力

6. METTL1 加速體內(nèi)熱處理后HCC的轉(zhuǎn)移
       利用體內(nèi)HCC轉(zhuǎn)移模型進一步研究METTL1在IRFA后HCC復發(fā)中的致癌功能。在脾內(nèi)注射模型中，將經(jīng)過熱處理的METTL1敲除的MHCC97H細胞和對照細胞注入NCG小鼠脾臟，以評估肝轉(zhuǎn)移情況（圖6A）。數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)熱處理的對照組細胞形成了更多的肝轉(zhuǎn)移瘤（7/7），而 METTL1 敲除組則顯著減少HCC腫瘤（分別為3/7和2/7）（圖 6B-6F）。此外，腫瘤組織中METTL1、WDR4、Ki-67、SLUG和SNAIL 的表達水平以及m7G tRNA的修飾水平在熱處理對照組中均有所上升，而在METTL1敲除組中則有所下降（圖6G-6M）。進一步用敲除METTL1的MHCC97H細胞建立尾靜脈注射模型（圖7A），以評估 METTL1在熱處理后調(diào)控肺轉(zhuǎn)移的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正如預期的那樣，熱處理后對照細胞組出現(xiàn)更多的肺轉(zhuǎn)移（圖7B、7D和7E）。肺重量與體重的比值也顯示亞致死性熱應激誘導的肺轉(zhuǎn)移負擔更高（圖7C）。重要的是，消耗METTL1顯著抑制HCC 細胞的肺轉(zhuǎn)移和增殖活性，這一點從尾靜脈注射模型中腫瘤負荷的減少和Ki-67水平的降低可以看出（圖7F-7I）。因此，這些數(shù)據(jù)揭示METTL1 在熱處理后對體內(nèi)轉(zhuǎn)移的促進具有重要作用。

圖6. METTL1缺失在體內(nèi)顯著抑制亞致死性熱應激下HCC細胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移

圖7. METTL1缺失在體內(nèi)顯著抑制亞致死性熱應激下HCC細胞的肺轉(zhuǎn)移

7. METTL1在體內(nèi)促進IRFA后的HCC轉(zhuǎn)移
       在原位異種移植HCC模型中進行IRFA。8周后對小鼠進行解剖以評估不同器官（包括肝臟和肺臟）的轉(zhuǎn)移情況（圖8A）。對所有組織進行HE染色定量后，發(fā)現(xiàn)shNC + IRFA 組（7/7）肝內(nèi)轉(zhuǎn)移較多（圖8B、8C、8E 和8F）。值得注意的是，在shNC + IRFA 組發(fā)現(xiàn)了肝外轉(zhuǎn)移，包括肺、腹壁、脾、腎、膈、腸和腸系膜（圖8D、8G、8H）。正如預期的那樣，METTL1基因敲除顯著抑制IRFA 誘導的肝轉(zhuǎn)移和其他器官轉(zhuǎn)移，尤其是肺轉(zhuǎn)移的趨勢。這些數(shù)據(jù)證明METTL1在IRFA后促進HCC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生理功能。

圖8. METTL1在體內(nèi)促進IRFA后的HCC轉(zhuǎn)移

結(jié)論
       綜上所述，本研究提供了證據(jù)，證明在亞致死熱應激下，METTL1通過促進SLUG/SNAIL mRNA翻譯，以m7G tRNA修飾依賴的方式促進HCC轉(zhuǎn)移，為防止射頻熱消融治療后HCC轉(zhuǎn)移提供了分子基礎(chǔ)。

實驗方法
細胞培養(yǎng)，動物實驗，細胞活力和克隆形成檢測，細胞周期和細胞凋亡檢測，遷移和侵襲實驗，RNA提取和RT-qPCR，northern blot，northwestern blot，western blot，HE染色，免疫組化分析，多聚核糖體結(jié)合mRNA測序， m7G tRNA還原和斷裂測序（TRAC-seq），質(zhì)粒構(gòu)建和慢病毒轉(zhuǎn)導，體外亞致死熱處理模型構(gòu)建，體內(nèi)射頻消融不充分（IRFA）實驗，IRFA動物模型構(gòu)建，轉(zhuǎn)移動物模型構(gòu)建
參考文獻
Zhu S, Wu Y, Zhang X, Peng S, Xiao H, Chen S, Xu L, Su T, Kuang M. Targeting N7-methylguanosine tRNA modification blocks hepatocellular carcinoma metastasis after insufficient radiofrequency ablation. Mol Ther. 2023 Jun 7;31(6):1596-1614. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.08.004. Epub 2022 Aug 13. PMID: 35965412; PMCID: PMC10278047.