microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗
| 簡介： | microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗 |
| 提供商： | 上海英拜 |
| 服務名稱： | microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗 |
microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗 環狀RNA(circRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼RNA,不翻譯蛋白。但在細胞中它們能夠調控其他基因的表達變化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA結合位點，在細胞中起到miRNA海綿（miRNA sponge）的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，這一作用機制被稱為競爭性內源RNA（ceRNA）機制。因此，通過與疾病關聯的miRNA相互作用，circRNA和lncRNA在疾病中發揮著重要的調控作用。研究cirRNA、lncRNA的調控機制需要先找到與cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA，而熒光素酶報告基因實驗可以用來證明miRNA與circRNA, miRNA與lncRNA的直接相互作用。 英拜生物microRNA報告基因實驗流程： 1. microRNA靶點的預測 利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預測靶點序列。 2. 獲得microRNA靶點序列 根據提供的靶序列，合成兩條互補的單鏈DNA模板。或者，設計引物PCR擴增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全長序列或靶標序列)。 3. cirRNA靶序列克隆 將合成的兩條單鏈退火成雙鏈（具有粘性末端），或將PCR產物雙酶切，后連入經過同樣雙酶切的Psicheck-2載體中，連接產物轉化大腸桿菌DH5α。 4. 陽性克隆鑒定。 挑選轉化的菌落，PCR篩選含有插入片段的陽性克隆，測序驗證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。 5. 細胞轉染準備 將psicheck-2報告基因載體、microRNA mimics或microRNA negative control共轉染293T或Hela細胞。 6. 熒光素酶檢測 報告基因載體與microRNA mimics或microRNA negative control共轉染293T或Hela細胞24-72h后，進行雙熒光素酶檢測，確定目的microRNA的靶基因。 7. 整理分析數據，得出結論。 提供有microRNA靶序列的報告基因質粒、甘油保存菌株各一支。附實驗報告，包括載體構建過程，鑒定記錄，測序報告，細胞轉染，熒光檢測。   |
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