Mutant p53 cancers reprogram macrophages to tumor supporting macrophages via exosomal miR-1246
p53突變型腫瘤通過外泌體miR-1246將巨噬細胞重編程為支持腫瘤生長的巨噬細胞
 
TP53突變體（mutp53）參與大多數人類癌癥的發病進程。特定的mutp53蛋白獲得與野生型蛋白的腫瘤抑制活性不同的致癌功能。腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages, TAMs）是實體瘤的標志，通常與不良預后相關。來自美國國立衛生研究院的Curtis C. Harris團隊近期在《Nature communications》（IF=12.124）上發表論文報告了人類mutp53癌細胞將巨噬細胞重編程為腫瘤支持性和抗炎狀態巨噬細胞的非細胞自主機制。攜帶致癌活性mutp53的結腸癌細胞選擇性地釋放富含miR-1246的外泌體。相鄰巨噬細胞攝取這些外泌體后觸發miR-1246依賴的重編程將巨噬細胞轉化為癌癥促進狀態的巨噬細胞。Mutp53重編程 TAMs有利于抗炎免疫抑制且TGF-β活性增加。這些研究結果提示mutp53在參與免疫系統促進癌癥進展和轉移微環境中發揮致癌作用。
 
 
研究結果

1. 攜帶mutp53的腫瘤細胞將巨噬細胞重編程

圖1 攜帶mutp53的癌細胞對巨噬細胞發揮非細胞自主作用。a. 人原代單核細胞分別在3種不同巨噬細胞譜系(M0, M1及M2)及具有不同p53突變狀態的HCT116細胞中進行生長和分化; b. 人原代單核細胞如a中培養并與含mutp53的HT29共培養; c. 共培養的巨噬細胞接種于cy-3-明膠覆蓋的載玻片上48小時，并檢測明膠降解速率; d. 共培養細胞采用CD163和CD206熒光抗體染色并通過流式細胞儀分析; e. 共培養的巨噬細胞接種在玻片并與熒光酵母聚糖顆粒孵育24小時后檢測酵母聚糖吞噬作用；f. g. 共培養的巨噬細胞收集后通過電阻抗重新接種，5天后檢測遷移(f)和侵襲(g).

1. mutp53腫瘤細胞釋放的外泌體攜帶特異性的miRNA標簽

• 2. 腫瘤細胞釋放的外泌體被相鄰巨噬細胞攝取. a. 從含野生型、突變型或敲除型p53的HCT116細胞中分離外泌體并通過Western blot鑒定；b.外泌體粒徑檢測；c. 外泌體濃度檢測；d. 在與巨噬細胞孵育24或48小時前，使用syto RNA標記外泌體，采用延時電影捕獲外泌體攝取積累。e. 外泌體提取RNA，并檢測RNA完整性及質量，并歸一化為豐度最高的100個miRNAs. f. mutp53型HT29細胞與對照相比變化倍數超過2倍的miRNAs. g. 4種主要miRNAs的變化倍數.

1. 外泌體miR-1246與腫瘤細胞及腫瘤相關巨噬細胞中的mutp53相關

• 3 mutp53腫瘤細胞釋放的外泌體攜帶特定的miRNA. a.巨噬細胞與HCT116細胞共培養，檢測miR-1246; b. 巨噬細胞與含不同p53突變狀態的HCT116細胞分離的外泌體(10μg)共培養，檢測miR-1246, miR-21及miR-4454; c. M1及M2型巨噬細胞轉染LNA-miR-1246 mimic或對照后檢測TNF-α 和 IL-10. d. HCT116 mutp53細胞轉染miR-1246 mimic，miR-1246 inhibitor或對照. 48小時后，與M2巨噬細胞共培養3天并檢測TNF-α, CCL2及IL-10. e. HCT116 mutp53細胞分離外泌體并通過不同尺寸柱子分離游離蛋白。巨噬細胞與外泌體(exos)或游離蛋白(Prot)孵育并檢測相關基因表達量; f. M2巨噬細胞與不同狀態p53的HCT116外泌體共培養不同時間后檢測pre-miR-1246.

1. Mutp53觸發miR-1246依賴性的巨噬細胞重編程

• 4. miR-1246與mutp53相關且在重編程腫瘤相關巨噬細胞中發揮作用. a.b. M2巨噬細胞與mutp53或野生型p53 HCT116細胞共培養6天，將重編程巨噬細胞與HCT116野生型細胞混勻后接種到NOD-SCID小鼠上，每周觀測腫瘤大小. c.d. 在第56天，處死小鼠，取出肝和肺檢測轉移灶；e.f. M2巨噬細胞轉染miR-1246 mimic 及空載，3天后，將巨噬細胞與熒光標記的HCT116細胞混合并皮下注射到NOD-SCID小鼠后背.

5. Mutp53與結直腸癌患者腫瘤相關巨噬細胞呈正相關
 

• 5 Mutp53與結直腸癌患者的腫瘤相關巨噬細胞正相關. a.b. 與攜帶野生型p53的結直腸癌患者相比，攜帶mutp53人結直腸癌患者的癌腺體上皮細胞中p53呈強陽性免疫染色且與周圍基質細胞中CD163和CD206呈相關性. c.d. 與野生型p53病例相比，攜帶mutp53結直腸癌患者的侵襲前沿中呈現彌散且強烈的CD206免疫陽性. e. mRNA表達譜分析. f. 攜帶不同p53的結直腸癌患者的生存曲線分析.

6. Mutp53與結直腸癌患者的miR-1246正相關
 
 

• 6 Mutp53與結直腸癌患者miR-1246呈相關性. a. 27例野生型p53的結直腸癌患者和28例mutp53患者的miRNA芯片. b. 與野生型P53病例相比，攜帶mutp53患者的上皮細胞和基質細胞呈miR-1246強陽性染色. d. 結直腸癌患者外泌體miRNA檢測.

 
7. 結直腸癌患者TGF-β信號通路和免疫抑制
 
 

• 7 攜帶mutp53的結直腸癌患者TGF-β信號通路和免疫抑制增加. a.b. 與野生型p53結腸癌患者相比，攜帶mutp53的結直腸癌患者呈現p53強陽性上皮細胞染色，且與FOXP3非上皮細胞免疫染色相關. c.d. GSEA分析p53獲得性突變結腸癌細胞與其他突變類型結腸癌細胞的炎性基因集合與TGF-β信號通路基因集合. e. 假說圖.

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