細胞外囊泡（EVs）不僅對疾病的發病機制產生重大影響，而且對其治療干預作用也有重大影響，這取決于在其起源細胞中觀察到的差異。線粒體可以通過EVs在細胞之間運輸，以促進病理變化。在這項研究中，我們發現來源于M1巨噬細胞（M1 EVs）的EVs包裹炎性線粒體，可以穿透胰腺β細胞。炎性線粒體與胰腺β細胞的線粒體融合，導致脂質過氧化和線粒體破壞。此外，線粒體DNA（mtDNA）片段被釋放到胞質溶膠中，激活STING通路并最終誘導細胞凋亡。脂肪來源干細胞（ADSC）釋放的EVs在抑制M1巨噬細胞反應方面的潛力顯示出希望。隨后，利用ADSC-EVs并用F4/80抗體修飾以特異性靶向巨噬細胞，旨在體內治療胰腺β細胞的鐵死亡?？傊?，該數據進一步證明，M1表型巨噬細胞分泌的EVs在β細胞鐵死亡中起主要作用，并且修飾的ADSC-EVs表現出相當大的潛力，可以作為靶向遞送到巨噬細胞的載體。

技術路線：

主要研究結果：

1 M1巨噬細胞通過EV將線粒體轉移到胰腺β細胞

為闡明來源于M1巨噬細胞的EVs（M1 EVs）對β細胞凋亡作用的分子機制，首先從正常小鼠胰腺組織中分離胰腺駐留巨噬細胞在體外培養，并命名為M0巨噬細胞。然后將M0巨噬細胞極化為M1和M2表型。隨后，通過超速離心分離EV。使用蛋白質組學技術分析了這些EV的蛋白質圖譜，并對其功能和亞細胞定位注釋進行了分類。主要類別包括細胞質、外泌體、溶酶體、細胞核、線粒體和質膜（圖1a）。這些數據表明，線粒體成分在被M1巨噬細胞分泌之前被封閉在EVs內。為進一步驗證線粒體通過EVs轉移，通過蛋白質印跡和免疫電子顯微鏡在EVs中評估了ATP5A（一種特異性線粒體標記物）的存在。圖1b、圖c所示結果表明，ATP5A在M1 EV中陽性表達。此外，位于線粒體基質內的蛋白質VDAC、COX IV和PDHA也在M1 EV中表現出陽性表達，這通過蛋白質印跡分析得到了證實（圖1d）。這些蛋白質分別構成線粒體外膜和線粒體內膜，并參與電子傳輸鏈的最后階段。本研究調查了M1巨噬細胞分泌的EVs中線粒體成分的存在。然而，是否所有線粒體都被包裹在這些EV內還有待確認。為解決這一問題，對從M1 EV中提取的DNA進行了全基因組PCR分析。結果顯示，成功擴增了66個對應于整個線粒體DNA（mtDNA）基因組的擴增子。隨后的擴增子測序證實了EVs內完整線粒體的包封，隨后將其運輸出細胞（圖1e）。

為直觀檢測線粒體通過EVs轉運從M1巨噬細胞轉移到胰腺β細胞，使用GFP標記M1巨噬細胞中的線粒體，而使用Mito TrackerDeep Red標記β細胞（β TC-6細胞）中的線粒體。隨后，使用Transwell單元培養細胞，48小時后觀察到GFP熒光。然而，用GW4869預處理的M1巨噬細胞熒光強度顯著降低（圖2a）。GW4869是一種公認的巨噬細胞外泌體釋放抑制劑，如作者的研究所示，在減少M1巨噬細胞中EVs的釋放方面表現出顯著的功效。

圖1：源自巨噬細胞的EVs含有包裝線粒體

2 源自M1巨噬細胞的炎性線粒體誘導β細胞凋亡

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的熒光探針。在正常線粒體中，JC-1在線粒體基質中聚集形成聚合物，并發出強烈的紅色熒光。當線粒體膜電位低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，從而產生綠色熒光。在與M1巨噬細胞共培養后，使用JC-1細胞評估TC-6細胞的線粒體膜電位。結果顯示，與對照細胞相比，表現出JC-1綠色熒光的陽性染色細胞比例顯著增加。然而，在經GW4869預處理的M1巨噬細胞共培養的TC-6細胞中，這一比例顯著降低（圖2b）。在此期間，還使用膜聯蛋白V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒評估βTC-6的細胞凋亡。這些發現與使用JC-1檢測方法獲得的結果一致。具體而言，與M1巨噬細胞共培養的TC-6細胞中膜聯蛋白V陽性細胞的比例顯著高于正常細胞。相反，在與用GW4869預處理的M1巨噬細胞共培養的TC-6細胞中觀察到膜聯蛋白V陽性細胞的顯著減少（圖2b）。作者的研究結果表明，給予GW4869可減少巨噬細胞通過細胞囊泡分泌釋放線粒體。此外，作者觀察到用GW4869處理導致巨噬細胞中GFP熒光的顯著增加。這些結果表明，線粒體轉移是通過EVs的釋放發生的。

圖2：研究線粒體在M1巨噬細胞和β TC-6細胞之間的轉移以及隨后對β TC-6細胞中細胞凋亡的分析

活化的巨噬細胞進行代謝重編程，從而誘導促炎表型。這種代謝轉變的特征是巨噬細胞線粒體從ATP產生轉變為線粒體活性氧（ROS）的產生。此外，線粒體產生的這種ROS也由巨噬細胞分泌，并被其他細胞（如心肌細胞）吸收，以誘導細胞凋亡。在作者的研究中，M0巨噬細胞的線粒體被GFP標記，其激活了炎癥M1和抗炎M2表型。隨后，從細胞上清液中選擇M1和M2巨噬細胞分泌的線粒體，并使用透射電子顯微鏡和流式細胞術進行檢測。為直觀地檢測胰腺β細胞和巨噬細胞之間的線粒體融合，源自GFP標記的M1巨噬細胞線粒體被引入到以Mito Tracker Deep Red不同濃度標記的β TC-6細胞中。隨后，對熒光共定位進行分析，作者的研究結果顯示，β TC-6細胞中存在綠色熒光，隨著線粒體濃度的升高，綠色熒光的強度逐漸增加，在25和30 μg/mL時達到峰值。綠色熒光與紅色熒光共定位，在相同的像素中觀察到紅色和綠色信號之間的熒光定量（圖3a）。這些數據提供了β細胞的線粒體與來源于M1巨噬細胞的線粒體融合的證據。為研究M1巨噬細胞的炎性線粒體對胰腺β細胞凋亡的影響，作者從M1和M2巨噬細胞的細胞上清液中分離線粒體，并以不同劑量將其與β TC-6細胞共培養。研究結果表明，隨著M1巨噬細胞中線粒體濃度的增加，凋亡細胞的比例逐漸增加。這種增加在25和30 μg/mL的濃度下達到峰值。然而，通過檢測JC-1和膜聯蛋白V，M2巨噬細胞的線粒體沒有觀察到顯著變化（圖3b，c）。

為研究線粒體通過EV轉運在胰腺β細胞和巨噬細胞之間的轉移，作者在不同濃度下孵育了來源于GFP標記的M1巨噬細胞和用Mito TrackerDeep Red標記的β TC-6細胞的EV。隨后分析了熒光的共定位，發現結果支持線粒體定向轉移的概念。具體而言，作者在TC-6細胞中觀察到綠色熒光，隨著EVs濃度的增加，綠色熒光的強度逐漸增加，在1×108和1×109粒子/mL處達到峰值。紅色熒光也與綠色熒光共定位，在相同的像素中觀察到紅色和綠色信號之間的熒光定量（圖4a）。對TC-6細胞的線粒體膜電位和凋亡進行評估，結果與定向線粒體轉移的概念一致。隨著M1巨噬細胞中EVs濃度的增加，觀察到凋亡細胞比例逐漸增加。這種增加在1×108和1×109顆粒/mL的濃度下達到最大值。相反，如JC-1和膜聯蛋白V分析所示，M2巨噬細胞的線粒體中沒有觀察到顯著的變化（圖4b，c）。因此，使用25 μg/mL M1線粒體（M1 Mito）和1×108個粒子/mL M1 EVs進行后續實驗。

圖3：巨噬細胞來源的線粒體與β TC-6 細胞孵育后的凋亡分析

圖4：線粒體通過EV的運輸從巨噬細胞轉移到 β TC-6 細胞

3炎性線粒體通過鐵死亡誘導β細胞凋亡

鐵死亡是一種鐵依賴性的調節性壞死，線粒體在這一過程中發揮著重要作用。在作者的研究中，他們初步評估了EVs或線粒體處理后β TC-6細胞中的ROS、游離Fe2+水平和線粒體脂質過氧化。該評估通過用MitoSox Red、FerroOrange和MitoPePDPP對細胞進行染色來進行。研究結果顯示，與正常細胞相比，EVs或線粒體處理的β細胞中MitoSox Red、FerroOrange和MitoPePDPP的熒光強度顯著更高。此外，免疫熒光定位分析表明，大多數MitoSox Red、FerroOrange和MitoPeDPP定位在線粒體中。將Ferrostatin-1（Ferro-1，一種脫鐵抑制劑）添加到M1 Mito或M1 EVs處理的β TC-6細胞中，以驗證鐵死亡的作用，并且添加Fer-1后，MitoSox Red、FerroOrange和MitoPePDPP的熒光強度顯著降低（圖5a-c）。線粒體形態變化是鐵死亡的可靠生物標志物，鐵死亡是一種以線粒體通透性增加和隨后破裂為特征的細胞過程。在作者的研究中，他們使用透射電子顯微鏡檢查了β TC-6細胞的線粒體形態。正常細胞具有明顯的線粒體嵴和完整的線粒體膜。相反，用M1 EVs或M1 Mito處理的細胞表現出線粒體腫脹、線粒體嵴溶解和破裂。此外，觀察到每個細胞的線粒體數量顯著減少（圖5d）。

圖5：不同處理方案對β TC 6細胞的mitoROS、Fe2+濃度、脂質過氧化含量和線粒體形態的影響

GSH/GSSG是指生物系統中還原型谷胱甘肽（GSH）與氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比例，是細胞氧化還原平衡的重要指標。與正常細胞相比，用M1 EVs或M1 Mito處理后，GSH/GSSG比率顯著降低。然而，如圖6a所示，通過添加Fer-1，緩解了當前情況下的這種干擾。隨后，作者研究了Fer-1對β TC-6細胞胰島素分泌和凋亡的影響。這些結果證實了作者之前的發現，證明在用M1 EVs或M1 Mito處理的β細胞中，Fer-1不僅阻止了細胞凋亡，而且增強了胰島素分泌，如圖6b-d所示。線粒體耗氧率（OCR）反映了線粒體在指定時間段內利用氧的速率。在作者的研究中，還評估了β細胞中的線粒體線粒體耗氧量（OCR），并觀察到M1 EVs或M1 Mito治療后線粒體ATP產生、基礎呼吸、最大呼吸、備用呼吸能力和質子泄漏的減少。然而，除了最大呼吸和質子泄漏外，Fer-1的加入減輕了這些影響（圖6e）。

圖6：Fer-1能有效恢復經各種處理后β TC 6細胞中下降的GSH/GSGG比值、細胞功能和OCR

4 胞質mtDNA誘導β細胞STING通路的激活

STING通路是先天免疫系統的重要組成部分，在識別胞質DNA和啟動針對病原體的免疫反應中發揮著關鍵作用。此外，它與細胞死亡途徑有關，如凋亡、焦亡和壞死。鐵死亡導致線粒體通透性增加和斷裂，然后mtDNA進入胞質溶膠形成胞質DNA。在本研究中，作者確定了STING通路是否被鐵死亡引起的mtDNA釋放激活。最初，作者證明了在用M1 EVs或M1 Mito處理后，TC-6細胞中線粒體釋放mtDNA。免疫熒光分析顯示，在M1 EVs或M1 Mito處理后，β TC-6細胞中的mtDNA與線粒體標記物（TOM20）分離。隨后，使用ImageJ共定位插件工具對免疫熒光圖像進行共定位分析。計算皮爾遜相關系數（Rr）以評估相關性程度。結果表明，在M1-EVs或M1-Mito處理后，β TC-6細胞的相關系數下降，但在添加Fer-1后增加（圖7a），這意味著Fer-1阻止了線粒體斷裂。環狀GMP-AMP合酶（cGAS）最初被鑒定為雙鏈DNA傳感器，在對抗病原體的先天免疫反應中發揮著至關重要的作用。為研究cGAS與線粒體之間的相互作用，使用免疫熒光圖像進行共定位分析，重點研究不同處理后TC-6細胞中TOM20與cGAS的共定位。所獲得的Pearson相關系數（Rr）低于5.0，表明線粒體和cGAS之間缺乏共定位（圖7b）。隨后的評估涉及檢查cGAS和胞質mtDNA之間的相互作用，這揭示了在各種處理后其在TC-6細胞中的存在（圖7c）。為研究cGAS和胞質mtDNA之間相互作用在不同處理下激活TC-6細胞STING通路的必要性，作者使用蛋白質印跡來評估GPX4的表達以及STING和IRF3的磷酸化水平。研究結果顯示，在用M1 EVs或M1 Mito處理的β TC-6細胞中，GPX4下調，STING和IRF3磷酸化增加。添加Fer-1產生了對比結果（圖7d）?？傊?，M1巨噬細胞利用EVs將線粒體運輸到胰腺β細胞。這些線粒體與β細胞中已經存在的線粒體的融合誘導細胞內Fe2+的積累，增加線粒體活性氧（ROS）和脂質過氧化。因此，線粒體破裂發生，隨后線粒體DNA釋放到細胞質中。隨后，STING通路被激活，最終導致細胞死亡（圖7e）。總之，M1巨噬細胞釋放EVs促進了胰腺β細胞的死亡。因此，解決M1巨噬細胞引起的胰腺β細胞的死亡需要一種集中的方法來阻止M1巨噬細胞的極化。通過有效抑制M1巨噬細胞的極化，可以減輕AP誘導的葡萄糖代謝異常。

圖7：各種處理后 β TC-6 細胞中的游離 mtDNA 激活 STING 通路

5 ADSC來源EVs的表面修飾

巨噬細胞表型從M1到M2的逆轉是通過MSC分泌EVs實現的。因此，來源于ADSCs的EVs已被用于抵消巨噬細胞的促炎表型，從而在體外和體內防止胰腺β細胞的死亡。首先，鑒定了人ADSCs的生物學特性，包括特異性標記表達和多分化潛能。作者的結果表明，人ADSCs對CD29、CD90和CD105呈陽性，并且ADSCs成功分化為軟骨細胞、脂肪細胞和成骨細胞。先前的報道已經表明，來源于MSCs的EVs攜帶某些miRNA和蛋白酶，這些miRNAs和蛋白酶可以逆轉巨噬細胞從M1到M2的顯性表型，并且用褪黑素預處理的MSCs分泌的EVs的逆轉作用顯著提高。在這項研究中，來自褪黑素預處理的ADSCs的EVs中，特異性miRNA（let-7b-5p和miR-24-3p）和蛋白酶（USP29）的水平顯著升高，這促進了M2極化。這些EV在褪黑素處理前后的顆粒大小分布、球形和EV標記蛋白方面相似，并顯著提高M1巨噬細胞中CD206陽性細胞的百分比。因此，在隨后的實驗中使用來源于褪黑素預處理的ADSCs的EV。為提高EVs在體內的遞送效率，制備了活化巨噬細胞靶向ADSC衍生的EVs，并使用點擊化學將抗F4/80抗體的大鼠單克隆抗體修飾在ADSC衍生EVs的表面上（稱為F4/80 EVs，圖8a）。分析了F4/80-EVs和正常EVs的生物學特性，數據顯示形態、顆粒大小分布或電動汽車標記蛋白沒有顯著變化，正常EVs中的F4/80除外（圖8b）。NF-kB是Rel家族成員的二聚體，由五種蛋白質組成。NF-kB（p65）和NF-kB1（p50）亞基的異二聚體是第一個被描述的NF-kB分子，在未刺激的細胞中被IkBα蛋白抑制。M1極化后，通過免疫熒光染色在巨噬細胞中檢測p65和p50（圖S12）。p50幾乎進入細胞核，一些p65留在細胞質中。為檢測F4/80-EVs對巨噬細胞極化的影響，作者對巨噬細胞進行體外免疫熒光染色和流式細胞術分析。這些分析旨在評估NF-kB1（p50）在細胞核中的表達，以及在相同實驗條件下進行各種處理后巨噬細胞內iNOS和CD206的百分比變化。免疫熒光顯示，在EV（圖8c）和F4/80-EV（圖8d）處理后，NF-kB1（p50）以濃度依賴的方式被有效地限制在細胞質中。使用FITC標記的NF-kB1（p50）和Cy5標記的IkBa來評估定位。最初在細胞核中觀察到FITC熒光信號；然而，在與EVs孵育后，FITC信號與細胞質中的Cy5共定位。任意單細胞的熒光定量顯示，在相同濃度下，F4/80-EV組的FITC信號比EV組少。使用流式細胞術分析M1巨噬細胞的標志物iNOS和M2巨噬細胞的標志器CD206的表達水平。結果顯示，在相同濃度下，F4/80-EV組中CD206陽性細胞的百分比顯著高于EV組（圖8e）。炎癥因子，白細胞介素（IL）?1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-6，在M1巨噬細胞和細胞懸浮液的轉錄和分泌過程中都被鑒定。這是使用實時PCR和ELISA實現的。使用從免疫熒光和流式細胞術分析中獲得的數據進一步驗證了這些發現的準確性。這些數據表明，anit-F4/80抗體對EVs的表面修飾賦予了在體外將巨噬細胞表型從M1轉化為M2的更好特性。

圖8：ADSC來源的EV的表面修飾和體外轉化巨噬細胞極化

6體內對巨噬細胞靶向傳遞F4/80-EVs及其對AP小鼠的治療作用

為進一步驗證胰腺中巨噬細胞對F4/80 EVs的F4/80介導的內吞作用，使用正常和AP小鼠通過每只小鼠腹膜內注射1×109個EVs或F4/80 EV顆粒來評估靶向遞送。使用全身熒光成像來分析EV的位置。如圖9a，b所示，EV處理后24小時，大多數熒光信號仍保留在正常小鼠的注射部位。相反，在EV處理的AP小鼠中，熒光信號擴散到腹部，胰腺顯示出比用F4/80 EV處理的AP小鼠更強的熒光信號。接下來，采集這些小鼠的器官以評估EV在體內的分布。與正常小鼠相比，EVs和F4/80-EVs主要積聚在胰腺和脾臟，部分分布在AP小鼠的腸道、腎臟和肝臟（圖9b）。F4/80-EVs在胰腺和脾臟中的熒光強度顯著高于EVs（圖9c）。接下來，作者使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢查了這些小鼠胰腺切片的熒光信號分布。結果與全身和器官成像結果非常一致。在EV和F4/80-EV處理后AP小鼠的胰腺中觀察到熒光；然而，F4/80-EV組的熒光顯著高于EV治療組（圖9d，e）。為驗證F4/80 EVs在體內靶向巨噬細胞的遞送，用Cy5標記的兔抗F4/80多克隆抗體用于定位胰腺切片中的巨噬細胞，用FITC標記的抗逆轉錄病毒抗體用于定位修飾EV表面的大鼠抗F4/80多克隆抗體。雙陽性細胞表明巨噬細胞含有F4/80-EV，其隨F4/80-EVs濃度的增加而增加。胰腺切片中的雙陽性細胞逐漸增加，峰值為每只小鼠5×108和1×109個顆粒（圖9f，g）。

為研究F4/80 EVs和EVs對巨噬細胞極化的影響及其在體內的治療效果，基于先前的報告，作者通過5次腹膜內注射，間隔3天，向AP小鼠全身施用EVs。使用實時成像系統在治療后24小時進行全身熒光成像（圖10a）。隨著F4/80-EV劑量的增加，熒光信號在胰腺和注射部位變得更加集中。糖耐受測試顯示，所有EV治療組均有顯著改善。每只小鼠1×109個顆粒的F4/80-EV組在3周后首先恢復到正常水平，而每只小鼠5×108個顆粒的F4/80-EV和每只小鼠10×109個粒子的EV組在4周后恢復（圖10b）。為進一步驗證EV治療的各組對炎癥反應的抑制作用，使用ELISA評估血漿中炎癥因子的水平，即IL-1β、TNF-α和IL-6。結果表明，炎癥因子水平在EV處理后顯著降低。值得注意的是，每只小鼠1×109個顆粒劑量的F4/80-EV組、每只小鼠5×108個顆粒F4/80-EV組和每只小鼠10×109個粒子的F4/8o-EV組表現出比每只小鼠50×108個粒子的EV組更好的療效。此外，HOMA-β分析證實了上述發現。

接下來，作者使用抗iNOS和-CD206抗體分析了用EVs或F4/80EVS治療2、3和4周后AP小鼠的巨噬細胞極化。結果表明，與其他組相比，在每只小鼠1×109個顆粒的F4/80-EV組中CD206陽性細胞百分比最高。此外，F4/80-EV組中CD206陽性細胞的百分比（每只小鼠5×108個顆粒）幾乎等于EV組中每只小鼠1×109個顆粒的百分比（圖10c-e）。與治療效果一致，F4/80-EV組每只小鼠5×108個粒子，在體內將M1極化轉化為M2極化，類似于EV組每每只小鼠1×109個粒子（圖11）。

圖9：體外F4/80-EV靶向遞送至巨噬細胞

圖10：AP小鼠中EVs和 F4/80‐EVs的治療效果 

結論：

總之，作者在小鼠模型中檢測了PPDM的發病機制。該分析表明，來源于M1表型巨噬細胞的EVs具有將炎性線粒體轉運到β細胞中并通過鐵死亡和STING通路誘導β細胞死亡的能力。用抗F4/80抗體修飾ADSC分泌的EVs，用于靶向遞送至體內巨噬細胞，用于AP的異常葡萄糖治療。作者的研究結果進一步表明，M1表型巨噬細胞在β細胞衰竭和凋亡中發揮著重要作用，并且修飾的ADSC-EVs顯示出相當大的潛力，可以作為PPDM靶向遞送的載體。

實驗方法：

細胞培養，葡萄糖耐受試驗，細胞外囊泡分離，透射電鏡，納米粒子跟蹤分析，免疫電鏡，線粒體分離及轉染，線粒體呼吸測試，免疫熒光

參考文獻：

Gao Y, Mi N, Wu W, Zhao Y, Fan F, Liao W, Ming Y, Guan W, Bai C. Transfer of inflammatory mitochondria via extracellular vesicles from M1 macrophages induces ferroptosis of pancreatic beta cells in acute pancreatitis. J Extracell Vesicles. 2024 Feb;13(2):e12410. doi: 10.1002/jev2.12410. PMID: 38320981; PMCID: PMC10847061.