宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）和腺癌（CAde）是宮頸癌（CC）的兩種主要病理類型，但其腫瘤和免疫微環境的高分辨率異質性仍然難以捉摸。在這里，作者對5個CSCC和3個CAde樣本進行單核RNA測序（snRNA-seq），并系統地概述了它們的特異性轉錄組圖譜。作者發現，與CAde中的細胞相比，CSCC中的CD8+T細胞更具細胞毒性，但T耗竭更低，并且吞噬作用的MRC1+巨噬細胞在CSCC中特異性富集。有趣的是，作者發現促腫瘤相關的肌成纖維（myoCAF）和癌癥相關的血管成纖維（vCAF）在CSCC中更豐富，并進一步驗證了它們在體外的促腫瘤作用。此外，作者還通過揭示惡性上皮細胞轉錄譜的異質性，鑒定了一些針對CSCC的特異性化療藥物（達沙替尼和達馬莫德）和CAde（乙嘧啶和拉帕替尼），并進一步驗證了它們在細胞系和構建的CC衍生類器官中的特異敏感性。細胞-細胞通信網絡顯示，NRG1-ERBB2和FN1-ITAG3的通路分別對CAde和CSCC具有特異性，這可能部分解釋了已鑒定化療藥物的特異性。作者的研究描述了CSCC和CAde之間的免疫異質性和特定的細胞相互作用，這為揭示發病機制和設計個性化治療提供見解。該研究于2023年10月發表在《eBioMedicine》，IF 11.1分。

技術路線：

主要研究結果：

1. CSCC和CAde的單細胞轉錄組景觀

         為闡明CSCC和CADE之間腫瘤間和腫瘤內的異質性，作者對五個CSCC樣本（p8、p21、p48、p53、p54）和三個CADE樣本進行snRNA序列（圖1A）。經過數據質量控制和過濾，總共收集了82719個單細胞，平均每個細胞捕獲1854個基因。所有這些單細胞被注釋為九個主要細胞群：上皮細胞（CDKN2A、CDH1、EPCAM、MUC5B、WFC2和PTPRT）、間充質細胞（COL1A1、LAMA2和ACTA2）、T細胞（CD247、CD2、CD3E）、髓系細胞（MSR1和HLA-DPB1）、血管內皮細胞（EGFL7和EMCN）、血漿細胞（IGKC和MZB1）、淋巴內皮細胞（CCL21和Prox1）、B細胞（MS4A1）和母細胞（KIT和CPA3）（圖1B）。上皮細胞是CSCC和CADE樣本中最豐富的細胞類型。不同個體中九種細胞類型的分數變化很大，表明CC中個體間異質性巨大（圖1d和e）。

         為進一步探索CSCC和CAde之間上皮細胞的異質性，作者首先將上皮細胞分為21個不同的簇。作者測量了每個上皮細胞簇與參考細胞（血管內皮細胞）相比的相對CNV評分，簇1/5/6/7/8/9/12/14/17/19與參考細胞相比具有更高的CNV評分，因此他們被歸類為惡性上皮細胞（圖1f和g）。作者還測量了每種細胞類型的細胞周期狀態，并觀察到癌癥細胞顯示出最低的G1期百分比，這表明大多數癌癥細胞在DNA復制中更活躍（圖1h）。

圖1：宮頸鱗狀細胞癌和腺癌單細胞表達圖譜的構建

2. CSCC和CAde中T細胞和巨噬細胞亞群比例和功能不同

         T細胞是腫瘤微環境的主要組成部分，在抗腫瘤中起著關鍵作用，作者旨在進一步剖析CSCC和CAde之間T細胞亞群和功能狀態的異質性。根據其標記基因將T細胞進一步分為七個簇，即T_CD8+（CD8A和CD8B）、T_naive（TCF7、IL7R和CCR7），T_reg（IKZF2、IL2RA和FOXP3）、T_ex（PDCD1和LAG3）、T_nk（GNLY和NCAM1）、T_eff（NKG7、CX3CR1和FCGR3A）、T_prolif（CENPF、MKI67和TPO2A）（圖2a-c）。總的來說，T_CD8+和T_naive在CSCC和CAde中豐富。雖然P值沒有統計學意義，但CSCC中T_reg的比例似乎更高，CAde中T_ex的比例更高（圖2d）。作者還測量了每個簇的細胞毒性/耗竭/treg評分，以評估T細胞的功能狀態，其中T_eff、T_ex和T_reg分別獲得最高的細胞毒性、耗竭和treg評分（圖2e）。然后進一步比較了這兩種病理類型在細胞毒性和衰竭功能方面的差異。如圖2f所示，與CAde相比，CSCC獲得更高的細胞毒性評分，但消耗評分較低。TCGA隊列中的CSCC患者也被證實與CAde患者相比具有更高的細胞毒性評分（圖2g），并且在TCGA數據庫中的所有CC隊列（Log-rank P=0.00283，Log-rank檢驗）、CSCC隊列（Log-lank P=0.0026，Log-rak檢驗）中具有更高細胞毒性評分的患者有更好的預后（圖2h）。

         髓細胞在腫瘤微環境中也發揮著重要作用。在該研究中，共有6267個髓系細胞根據其標記基因重新聚類為14個亞簇，包括7個巨噬細胞（Macro-C1:PPARG；Macro-C2:SELENOP和MRC1；Macro-C3:SH3BP5；Macro-C5:GBP5；Macro-C6:VCAN和FCN1；Macro-C7:SP1）、5個樹突細胞（DC-C1:CD1A；DC-C2:LAMP3和CCR7；DC-C3:CLEC9A；DC-C4:BACH2；DC-C5:LILRA4）、1個循環細胞（TOP2A和MKI67），和未知亞型（圖2i）。每個樣品中七個巨噬細胞亞簇的組分變化很大（圖2j）。功能富集分析顯示，Macro-C1參與脂質分解代謝過程和固醇或膽固醇轉運，在調節巨噬細胞的吞噬作用和炎癥因子方面發揮關鍵作用。Macro-C4主要與蛋白質定位和細胞-細胞粘附有關。其他集群具有一些共同的功能特征，例如白細胞和T細胞激活。然而，抗原處理和呈遞的相關途徑在Macro-C2中顯著富集，這是吞噬作用隨后的反應，其在免疫調節中發揮關鍵作用（圖2k）。為進一步剖析已鑒定巨噬細胞簇的異質性，根據已知的基因marker測試了他們的功能評分。如圖2l所示，所有這些巨噬細胞簇都不能根據M1、M2、吞噬作用、血管生成以及骨髓來源的抑制細胞（MDSC）的評分很好地分離。值得注意的是，Macro-C2的吞噬作用得分最高，這與其抗原處理和呈遞的特定功能一致。此外，與CAde相比，CSCC獲得更高的吞噬作用得分（圖2m）。作者進一步在收集的樣本中驗證，與CAde相比，Macro-C2（MRC1+/CD68+）在CSCC中的含量明顯更高。

         總之，這兩種病理亞型的T細胞和巨噬細胞亞群的不同組分和功能狀態反映了它們對CC的特異性免疫反應，這可能為免疫治療提供見解。

圖2：CSCC和CAde中T細胞和巨噬細胞的特征和功能狀態

3. 與CAde相比，促腫瘤的vCAFs在CSCC中占主導地位

         作者進一步對間充質細胞進行重新聚類，并鑒定了四種主要的細胞類型，包括12種成纖維細胞亞型（COL1A1和COL1A2）、兩種平滑肌細胞亞類型（ACTA2、ACTG2和MYH11）、三種周細胞亞型（NOTCH3和RGS5）和另一種未定義的成纖維細胞（PTPRC和MUC16）（圖3a-c）。為了根據通路激活和基因表達譜進一步研究成纖維細胞的不同功能表型，使用分級聚類將12簇成纖維細胞分為四種主要表型（圖3d）。在這些亞型中，由Fib-C1/C10/C11/C12簇組成的ITGA1+成纖維細胞被定義為具有高表達ITGA1、POSTN、MMP11、FN1、FAP、COL1A1和COL8A1。 ADAMTS19+成纖維細胞由具有高表達ADAMTS19、NCAM1和COL14A1的Fib-C2/C3組成。LMCD1+成纖維細胞由高表達LMCD1、EPAS1、VEGFA、COL4A1和SOD2的Fib-C4/C5組成。PAMR1+成纖維細胞由具有高表達PTCH1和DACH1的Fib-C6/C7/C8/C9組成（圖3e）。根據已報道的成纖維細胞分類，GO注釋顯示，PAMR1+成纖維細胞參與器官發育和細胞對激素刺激的反應，即發育CAFs（dCAFs）。LMCD1+成纖維細胞涉及VEGFA-VEGFR2信號通路、傷口愈合、管形態發生、MAPK和PI3K-Akt-mTOR信號通路，進一步定義為vCAFs。ADAMTS19+成纖維細胞主要參與NABA CORE MATERISOME和ECM組織，被定義為基質CAFs（mCAFs）。 myoCAF主要介導細胞外基質（ECM）組織的途徑，MET促進細胞運動（圖3f）。

         接下來，使用monocle2來推斷成纖維細胞的潛在發育軌跡。有趣的是，作者發現mCAFs和dCAF主要位于發育軌跡的起點，而myoCAF和vCAFs分別位于兩個分支（圖3h）。在CSCC和CAde中觀察到成纖維細胞的相同發育軌跡（圖3i）。此外，在發育過程中，基因表達譜進一步聚類為三個不同的聚類，進一步的功能富集分析表明，癌癥相關通路（包括MAPK信號通路和胰島素受體信號通路）在vCAFs轉變過程中是活躍的。而ECM組織、結締組織發育和膠原代謝過程在myoCAF過渡過程中是活躍的（圖3j）。為進一步探索偽時間的調節機制，鑒定了異常活躍的TF。一些轉移相關的轉錄因子（如BACH2、TWIST2、CREB5和CUX1）和促血管生成轉錄因子（FOXO1、BACH1）參與vCAFs的發育過程，而ETV6和STAT2參與myoCAFs的發育進程（圖3k）。

圖3：CSCC和CAde中間充質細胞的特性和亞簇

         然后，作者使用TCGA隊列測量已確定的成纖維細胞亞型的預后意義。在TCGA數據庫中的所有CC隊列、CSCC隊列中，myoCAF與患者總生存率呈負相關（圖4a）。在TCGA數據庫中的所有CC隊列中，vCAFs也與患者總生存率呈負相關（圖4a）。作者進一步驗證了與使用mIF外部樣本的CAde相比，vCAFs和myoCAFs在CSCC中更豐富（圖4b和c）。然后，作者從一個收集的CC樣品（患者#46）中提取并培養原代成纖維細胞。通過流式細胞術對原代myoCAFs（POSTN+/COL1A1+）和vCAFs（SOD2+/COL1A1+1）進行分類，并通過免疫熒光染色進一步驗證它們（圖4d）。Transwell分析顯示，myoCAFs和vCAFs的條件培養基（CM）都可以顯著促進CC細胞的遷移能力（圖4e和f）。與myoCAFs或對照組的CM相比，vCAFs的CM似乎顯示出更高的促進血管生成能力（圖4g）。

         此外，vCAFs中TGFB1和VEGFA的表達水平顯著高于myoCAFs，這被證明可以促進腫瘤進展和血管生成（圖4h）。總之，該研究結果證實，CC樣品中的原代vCAFs和myoCAF在體外顯示出促轉移的潛力。

圖4：已鑒定的腫瘤前成纖維細胞的功能驗證

4. CSCC和CAde的不同惡性上皮亞型及其差異表達基因

         為更好地揭示CSCC和CAde的特定腫瘤內在特征，作者將所有惡性上皮細胞重新劃分為11個簇，并鑒定了它們的標記基因（圖5a-c）。有趣的是，基于GSVA分析，來源于CSCC和CAde的惡性上皮亞群可以很好地分離（圖5d）。值得注意的是，AKT、MTOR和ERBB2的相關通路在CAde樣本中是活躍的，而HINATA_NFKB_IMMU-INF在CSCC樣本中是活躍的。這些發現表明CSCC和CAde之間具有不同的內在功能，這有助于揭示CSCC和CAde患者的不同發病機制和選擇敏感的靶向藥物。

         癌癥干性已被證明通過排出T細胞來影響一系列人類癌癥的免疫抑制。作者測量了每個簇的干性評分，發現與CSCC相比，CAde獲得更高的腫瘤干性，這表明CAde具有更具抑制性的免疫微環境（圖5e）。基于此，作者旨在構建一個能夠區分CSCC和CAde的基因面板。在重置閾值（|Log2FC|>1，P<0.05，Wilcoxon秩和檢驗）后，建立了包含14個預后相關基因的基因集（圖5f）。為了評估建立的判別基因組的準確性，作者在組織微陣列上進行了IHC染色。如圖5g和h所示，證實MTSS1在CSCC樣品中過表達，而POLA1在CAde樣品中上調。ROC曲線證實，該基因組在CAde和CSCC分類方面表現出良好的性能（圖5i）。

5. 靶向CSCC和CAde的化療藥物的鑒定

         結合已鑒定的DEG，使用SCENIC算法進一步剖析上游調控分子（即TF）的異質性。如圖5j所示，針對CSCC鑒定了一系列特異性TF（HOXD8、ETS1、RXRA、MAFB、TBX6、IKZF1、STAT2、STAT1、MAF、SMAD3、GRHL3、TP63和HOXD10）和CAde（TEAD1、HNF4A、RFX2、XBP1、CREB3L1和HNF4G）。作者進一步測量了它們在CSCC（SiHa、CaSki和ME-180）和CAde（HeLa）細胞系以及TCGA隊列中的表達（圖5k）。TF基因調控網絡表明，CAde的過表達基因主要受CAde特異性TF的調控，在CSCC中反之亦然（圖5l）。然后，使用Beyondcell算法基于惡性細胞的表達譜來預測藥物敏感性（圖5m）。作者隨機選擇了一些藥物，以進一步驗證藥物篩選的預測準確性。如圖5n所示， CAde特異性藥物（二氫葉酸還原酶抑制劑：嘧啶胺；ERBB2抑制劑：拉帕替尼）在HeLa中的IC50值比在CaSki中的小。相反，CSCC特異性藥物（STAT5抑制劑：達沙替尼；MAPK抑制劑：多馬匹莫德）在CaSki中具有更好的細胞毒性功能。作者還從臨床CSCC和CAde樣本中構建了類器官，以更好地測試藥物敏感性，結果與CC細胞系中的結果基本一致（圖5o和p）。這些發現表明作者鑒定的藥物具有很強的可靠性，值得未來進一步探索。

         總之，作者區分了CC的兩種亞型之間的特定惡性上皮亞群，并基于它們的DEG建立了一個判別基因組。此外，作者預測并證實了對CSCC和Cade敏感的特異性藥物，這可以為臨床實踐中探索兩種病理性CC的個體化治療提供見解。

圖5：CSCC和CAde中惡性細胞的轉錄組異質性

6. 癌細胞與成纖維細胞在CSCC和CAde中的特異性細胞相互作用

         為研究CSCC和CAde之間細胞-細胞相互作用的異質性，使用CellphoneDB數據庫中的一組配體-受體（L-R）對來預測九種已鑒定的主要細胞類型之間的潛在相互作用。與CSCC相比，CAde具有更豐富的相互作用對，尤其是在上皮細胞和間充質細胞中（圖6a-c）。然后鑒定了屬于CSCC和CAde的特異性配體-受體對。有趣的是，作者發現CAde中的特異性配體-受體對比CSCC中的多（圖6d）。約68.5%的顯著相互作用對由CAde和CSCC共享，而23.5%的相互作用對是CAde特異性的。此外，在CSCC和CAde中，上皮細胞主導了來自間充質細胞的特異性信號傳導，這是作者以下分析的主要重點（圖6e）。進一步的CellChat分析顯示，癌癥細胞和已鑒定的CAF（NRG1-ERBB2/4和FN1-CD44/ITGAV/ITGA3/ITGB6/ITGB8/ITGB1）之間的信號通路分別在CAde和CSCC中特異性富集（圖6f）。值得注意的是，一些受體（ERBB2、ITGA3和ITGB6）主要在癌癥細胞中表達，其假定的配體（NRG1和FN1）在CAF中過表達（圖6g）。此外，NRG1-ERBB2和FN1-ITGA3的相互依賴的配體-受體對分別在CAde和CSCC的細胞成分中表現出顯著表達（圖6h和i）。

         有趣的是，已鑒定的拉帕替尼是一種ERBB2抑制劑，對CAde樣品特別敏感。先前的研究已經證明，STAT5和MAPK是惡性腫瘤中整合素的關鍵下游分子，作者發現靶向STAT5和MAPK分子的達沙替尼和Doramapimod對癌癥細胞系和CSCC的類器官顯示出特異性敏感性。總的來說，作者確定了CAFs和癌癥細胞之間CSCC（FN1-ITGA3）和CAde（NRG1-ERBB2）的特異性細胞相互作用，這也可以為這兩種不同CC類型選擇有前景的治療性化療藥物提供見解。

圖6：CSCC和CAde中惡性細胞與成纖維細胞之間的特異性通訊模式

結論：

         在這里，我們描述了單細胞溶液中五個CSCC和三個CAde樣本的不同轉錄組圖譜。這兩種病理類型之間關于上皮細胞、免疫細胞和成纖維細胞的異質性已經得到了很好的證明，一些有趣的發現（例如，特異性化療藥物、鑒定的LECs、鑒定的myoAF或vCAFs）通過mIF染色、提取原代CAFs、構建CC類器官等得到了進一步驗證（圖7）。與之前通過單細胞RNA測序對CC進行的研究相比，我們的研究為揭示CSCC和CAde之間致癌作用和腫瘤微環境的巨大異質性，以及為未來設計個性化治療策略提供了寶貴的資源。

參考文獻：

         Lin S, Sun Y, Cao C, Zhu Z, Xu Y, Liu B, Hu B, Peng T, Zhi W, Xu M, Ding W, Ren F, Ma D, Li G, Wu P. Single-nucleus RNA sequencing reveals heterogenous microenvironments and specific drug response between cervical squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. EBioMedicine. 2023 Nov;97:104846. doi: 10.1016/j.ebiom.2023.104846. Epub 2023 Oct 24. PMID: 37879219; PMCID: PMC10618708.