樹突狀細胞（DCs）是一種抗原呈遞骨髓細胞，調節T細胞的活化、運輸和功能。單核細胞來源的DCs與腫瘤抗原脈沖已廣泛用于癌癥治療性疫苗接種試驗，臨床結果好壞參半。在這篇研究中，作者提出了一個基于小鼠或人類DC祖細胞（DCPs）的細胞治療平臺，該平臺可以產生兩種免疫刺激細胞因子，IL-12和FLT3L。攜帶細胞因子的DCPs分化為傳統的i型DCs （cDC1）并抑制腫瘤生長，包括黑色素瘤和原位肝模型，而不需要抗原負載或清骨髓宿主調節。腫瘤反應涉及IL-12和FLT3L的協同作用，并與自然殺傷細胞和T細胞浸潤活化、M1巨噬細胞編程和缺血性腫瘤壞死有關。抗腫瘤免疫依賴于內源性cDC1擴增和干擾素γ信號，但不需要CD8+ T細胞毒性。細胞因子武裝的DCPs與抗GD2嵌合抗原受體（CAR） T細胞有效協同根除小鼠顱內膠質瘤，說明了它們在聯合治療中的潛力。本文于2023年9月發表在《Nature Cancer》，IF：22.7。

技術路線：

主要實驗結果

1. DCPs在小鼠中產生cDC1

        在小鼠和人類系統中，駐留在腦內的常見DC祖細胞（CDPs）是罕見的、有前景的cDC1前體。為了獲得能夠產生cDC1的細胞群，作者開發了一種從小鼠BM中體外生產cdp樣細胞的方案（圖1a）。這兩步過程包括造血干細胞和祖細胞（HSPCs）的短期擴增，然后在促進cDC1譜系承諾的條件下進行部分分化。BM細胞在含有干細胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）、FMS相關酪氨酸激酶3配體（FLT3L）、IL-3、IL-6和IL-1β（擴增期）的HSPC培養基中培養2-3天。然后將漂浮細胞在含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF/CSF2）和FLT3L（分化期）的cDC1培養基中再培養4 - 5天。所得到的細胞培養含有類似于CDPs的細胞（CD115+、CD11b?、CD11c?、CD103?、MHCII?、CD45R/B220?、CD117/KIT?/low和CLEEC9a?），在去除譜系陽性細胞后，這些細胞的富集率約為30%至70%（圖1b）。與BM駐留的CDPs不同，培養的CDPs樣細胞不表達CLE9a；此外，它們缺乏CD11c和CD103，這兩種蛋白在預cDC1和成熟cDC1中表達。由于它們與自然發生的CDPs相似但不相同，作者將這些細胞稱為DCPs。

        然后作者探索DCPs是否可以在小鼠中產生cDC1。作者使用CD45.1小鼠的BM細胞產生上述DCPs，或moDCs和成熟的cDC1樣細胞，使用既定的方案。作者在沒有事先骨髓消融的情況下，在基因CD45.2小鼠中靜脈注射每一種DC類型（2 × 106個細胞，間隔3天），并在第二次DC劑量4天后分析受體小鼠的脾臟（圖1c）。在本實驗和后續實驗中，流式細胞術用于識別細胞群的門控策略如圖1-6所示。與接受moDCs或cDC1樣細胞的小鼠相比，接受DCPs的小鼠脾細胞中供體來源的CD45.1+細胞的頻率更高（圖1d）。然后，作者根據早期的工作檢查了脾cDC1，發現cDC1內存在大量的供體嵌合，并且在較小程度上，在接受DCPs的小鼠中，cDC2 （CD11c+CD11b+MHCII+CD8a?）（圖1e）。相反，在接受moDCs或成熟cDC1樣細胞的小鼠中，供體cDC1嵌合現象可以忽略不計（<0.2%）。大多數DCPs來源的細胞是cDC1， cDC2和雙陰性（CD11b - CD8a -） cDCs（圖1f）。作者還研究了BATF3（一種對cDC1發育至關重要的轉錄因子）是否在體外產生DCPs，以及它們在轉移到受體小鼠后的植入和分化所必需的。從CD45.2 Batf3?/?小鼠的骨髓中可以成功建立DCPs，但在轉移到CD45.1小鼠時不能移。

        接下來，作者研究了皮下MC38結直腸腫瘤小鼠中供體DCPs、moDCs和cDC1樣細胞的命運（圖1g）。CD45.1+ DCPs來源的細胞比其他DC群體更有效地植入腫瘤和其他器官（圖1）。在腫瘤中，作者在Ly6C- F4/80- CD11c+MHCII+群體中鑒定出cDC1為CD103+CD11b-細胞，cDC2為CD103- CD11b+細胞。在獨立實驗中，DCPs衍生的細胞分別約占腫瘤相關cDC1和cDC2的35-45%和10%（圖1i）。DCPs對巨噬細胞等非cDC群體的貢獻很小（<1%），并且在脾臟、肺和肝臟中也能向cDC分化，而moDCs的cDC分化能力較低。綜上所述，在不需要事先的宿主調節的情況下，過繼性轉移的DCPs在腫瘤小鼠中有效地重建了cDC1，并在較小程度上重建了cDC2。

圖1 DCPs能在小鼠體內高效生成cDCs

2. IL-12促進DCPs分化為共刺激cDC1

        FLT3L是cDC1誘導和擴增的關鍵細胞因子。作者推斷，在DCPs來源的細胞中強制表達FLT3L會增加腫瘤中的內源性cDC1。為此，作者構建了一個慢病毒載體（LV），表達小鼠FLT3L和綠色熒光蛋白（GFP）；作為對照，作者使用僅表達GFP的LV。作者在第2天轉導BM來源的HSPCs，然后測量GFP表達和FLT3L分泌。轉導后的細胞在轉導后第6天有效表達GF，并強烈分泌FLT3L，這是在沒有外源FLT3L的情況下再培養7天的細胞條件下的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）所顯示。

圖2 攜帶細胞因子的DCPs激活免疫并抑制黑色素瘤生長

        然后，作者使用圖1a所示的方案，從CD45.1小鼠的BM中制備了對照DCPs （表達GFP的DCPs）和表達FLT3L和GFP的DCPs （以下簡稱DCP-FLT3L）。在本實驗和隨后的DCPS轉移實驗中，DCPS富集2小時后進行LV轉導。作者在攜帶皮下B16F10黑色素瘤的CD45.2小鼠中接種富集的DCPs或DCP-FLT3L。與對照DCPs相比，DCP-FLT3L有效地擴大了腫瘤和脾臟中的內源性cDC。此外，DCP-FLT3L增加了CD8+和CD4+ T效應細胞（CD44+CD62L?）。因此，FLT3l武裝的DCPs可能通過擴增內源性cDCs和T效應細胞啟動小鼠抗腫瘤免疫。

        IL-12是T細胞活化的關鍵細胞因子。鑒于IL-12提高了DCPs衍生的cDC1的T細胞共刺激能力，作者推斷DCPs轉基因表達IL-12將增強DPC-FLT3L引發的抗腫瘤免疫。作者在第2天轉導腦源性HSPCs生成DCP-IL-12（表達IL-12和GFP的DCPs）和對照DCPs（僅表達GFP的DCPs）。轉導后的細胞在轉導后第6天穩定表達GFP， ELISA檢測顯示分泌IL-12。為了研究移植，作者轉導了富集的CD45.1 DCPs，并在無腫瘤的CD45.2小鼠中接種了2×106個細胞。DCP-IL-12沒有被反選擇，保留了轉基因表達，并在受體小鼠的脾臟中以預期的頻率產生成熟的cDCs。

        接下來，作者通過將DCPs與IL-12或FLT3L轉導結合，在荷瘤小鼠中進行了DCPs轉移研究。在這些實驗中，IL-12與中性標記物dLNGFR（一種截斷的低親和力人神經生長因子受體）21偶聯，而FLT3L與GFP偶聯。作者在腫瘤攻擊后的第3天和第5天給B16F10腫瘤小鼠注射了1×106 DCP-IL-12和2×106 DCP-FLT3L的混合物（圖2a）。為了檢驗表達IL-12或FLT3L的DCPs的效果，作者將它們分別與表達GFP或dLNGFR的DCPs結合。對照小鼠接受磷酸緩沖鹽水（PBS）或表達GFP或dLNGFR的DCPs。在獨立實驗中，與單獨表達任一細胞因子的DCPs相比，DCP-IL-12和DCP-FLT3L（以下簡稱DCP-IL-12/FLT3L）的組合取得了更好的腫瘤控制效果（圖2b），包括隨訪時間較長的研。在最后一次DCPS輸注后的第1天至第8天，血清IL-12和FLT3L水平均急劇下降（圖2c），這表明受體小鼠體內無法穩定植入產生細胞因子的DCPS。

3. 細胞因子武裝的DCPs激活抗腫瘤免疫

        B16F10腫瘤（包括作者研究中使用的表達OVA的變體）含有很少的T細胞浸潤，并且對免疫檢查點阻斷反應較差。腫瘤內免疫細胞的流式細胞術分析揭示了DCPs衍生的IL-12和FLT3L之間的協同作用。與單獨表達任一細胞因子的DCPs相比，DCP-IL-12/FLT3L顯著增加了造血細胞、CD8+和CD4+ T細胞的腫瘤浸潤（圖2d）。此外，體外再刺激實驗顯示，DCP-IL-12/ FLT3L處理小鼠的一些腫瘤中活化的IFNγ+ T細胞比例更高（圖2e）。腫瘤切片免疫熒光染色和定量分析證實了這些結果（圖2f）。DCP-IL-12/FLT3L和DCP-IL-12均能增強腫瘤相關巨噬細胞（TAM） MHCII的表達（>90%；圖2g和擴展數據圖5d），表明獲得免疫刺激表型。最后，在DCP-IL-12/ FLT3L處理的小鼠中，腫瘤引流淋巴結（tdLNs）中CD44+CD62L?T效應細胞的相對豐度更高，表明激活了全身T細胞反應。這些結果表明，IL-12/ FLT3L武裝DCPs在T細胞貧乏的黑色素瘤模型中促進廣泛的免疫反應。

4. 細胞因子武裝的DCPs通過IFNγ重編程腫瘤微環境

        然后，作者對整個B16F10腫瘤進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析，作者在第二次DCPs給藥后6天進行了分析。由于黑素小體在黑色素瘤制備中大量存，作者只能準確地識別主要的細胞簇（圖2h）。盡管如此，作者觀察到與載體治療的腫瘤相比，DCP-IL-12/ FLT3L治療的腫瘤的癌癥和髓細胞中IFNγ和i型IFN信號通路以及其他免疫反應途徑（例如抗原遞呈）的激活，如根據Reactome和Hallmark對最不受管制的生物過程的無監督排名所示（圖2i，j）。正如預期的那樣，IFNγ僅在淋巴細胞簇中可檢測到表達。結合上述基于流量的數據，scRNA-seq分析強烈表明，DCP-IL-12/FLT3L激發了IFNγ反應，至少部分地通過對黑色素瘤和骨髓細胞的影響，有助于限制腫瘤生長。此外，在DCP-IL-12/FLT3L治療的黑色素瘤中存在抗血管生成反應（圖2k），這可能涉及IFN-γ27的直接血管修剪作用和間接機制；例如，通過m1編程（血管靜壓）TAMs28。

5. DCPs提供了一個替代moDCs的細胞治療平臺

        大多數載抗原DC的臨床前和臨床實驗使用的是moDCs。然后，作者研究了IL-12和FLT3L的轉基因表達是否會賦予moDCs在缺乏體外抗原負載的情況下擴增T細胞和控制腫瘤生長的能力。作者將1 × 106 DCP-IL-12或moDC-IL-12和2×106 DCP-FLT3L或moDC-FLT3L的混合物給予B16F10腫瘤小鼠，在腫瘤攻擊后的第3天和第5天（圖3a）。DCP-IL-12/FLT3L實現腫瘤穩定，而moDC-IL-12/FLT3L僅延緩腫瘤生長（圖3b）。在接受DCP-IL-12/FLT3L的小鼠中，這一結果與腫瘤中CD8+ T細胞的浸潤和活化顯著增加（圖3c）以及TDLN中cDCs和T效應細胞（CD44+CD62L?）的擴增相關。此外，經體外再刺激，DCP-IL-12/ FLT3L處理的小鼠腫瘤中表達IFNγ、顆粒酶B （GZMB）和腫瘤壞死因子（TNF）的CD8+ T細胞比例更高（圖3d）。雖然DCP-IL-12/FLT3L和moDC-IL-12/FLT3L均可適度增加腫瘤中CD4+ T細胞的浸潤和活化，但只有DCP-IL-12/FLT3L可增強tam中MHCII的表達。總體而言，DCP-IL-12/ flt3l處理小鼠的腫瘤細胞組成以T細胞為主，幾乎占活細胞的三分之二（圖3e）。這一結果可以解釋DCP-IL-12/FLT3L治療后觀察到的普遍IFNγ特征和標記的M1編程。

        上述研究使用了以1:2比例表達IL-12或FLT3L的混合dc。為了探索作者平臺的多功能性，作者從一個雙胞LV中共表達了這兩種細胞因子，即在同一個細胞中，這代表了一種更適合臨床翻譯的策略。DCP-IL-12/FLT3L和moDC-IL-12/FLT3L在體外共表達IL-12和FLT3L，并在B16F10模型中表現出抗腫瘤活性（圖3f、g）。在涉及LV分裂轉導的研究中觀察到，盡管moDC-IL-12/FLT3L劑量加倍可改善腫瘤控制，但DCPs比moDCs更有效。總的來說，這些臨床前結果表明，細胞因子武裝的DCPs為抗原不可知的DC治療應用提供了一種替代moDCs的策略。

        然后，作者在MC38模型中檢測DCP-IL-12/FLT3L，其特征是免疫抑制TAMS大量浸潤。MC38荷瘤小鼠的處理方法與上面圖3a所示的黑色素瘤研究相同。DCP-IL-12/FLT3L實現了實質性的MC38腫瘤控制（圖3h），促進免疫細胞浸潤（圖3i），誘導TAM獲得M1樣表型（圖3j，k）。此外，DCP-IL-12/FLT3L強烈擴增tdLNs中的cDCs和CD44+CD62L?T效應細胞（圖31），這與B16F10黑色素瘤模型中的發現一致。

圖3 DCPs為moDCs提供了一種有效的細胞因子遞送平臺

6. 腫瘤對細胞因子武裝DCPs的反應依賴于cDC1

圖4 腫瘤對細胞因子DCPs的反應是 cDC1 和 IFNγ 依賴性的，但不需要 CD8+ T 細胞

        為了探索腫瘤對DCP-IL-12/FLT3L反應的潛在機制，作者研究了DCPs轉移后早期時間點的B16F10腫瘤（第二次DCPs劑量后6天；圖4）。在腫瘤發展的早期階段，很少有造血細胞和CD8+T細胞浸潤，DCP-IL-12或DCP-IL-12/FLT3L僅適度增加了造血細胞和CD8+T細胞浸潤。然而，后一種治療顯著增加了腫瘤中活化的自然殺傷（NK）細胞的豐度（圖4b）。因此，DCP-IL-12/FLT3L的早期腫瘤反應可能主要涉及IL-12對NK細胞的依賴作用。有趣的是，DCP-IL-12和DCP-IL-12/FLT3L表現出雙重作用，減少腫瘤中的cDCs，同時增加tdLNs中的cDCs，包括CD11clow/+MHCII+/高遷移cDCs（圖4c、d）。這種反應伴隨著tdLNs中CD44+CD62L?T效應細胞的適度增加。相反，與tdln相比，DCP-FLT3L誘導腫瘤內cdc的增加更為明顯。這些結果支持了DCPs衍生的FLT3L直接促進內源性cDCs在腫瘤中的初始擴張的假設，而IL-12通過NK細胞衍生的IFNγ誘導它們從腫瘤微環境（TME）遷移到tdLN。這種遷移將使cDC能夠啟動tdLN中的T細胞啟動。

        然后，作者探索內源性cDC1和T細胞是否需要對DCP-IL-12/FLT3L的腫瘤抑制反應。在Batf3?/?受體小鼠中缺乏內源性cDC1完全否定了DCP-IL-12/FLT3L的治療活性（圖4e），并且無法在B16F10腫瘤中引起強大的T細胞浸潤和激活（圖4f，g），這表明細胞因子修飾的DCPs通過內源性cDC1激活抗腫瘤免疫。令人驚訝的是，DCP-IL-12/FLT3L在缺乏成熟T細胞和B細胞的Rag1?/?小鼠中也有效（圖4h）。在Rag1?/?小鼠的B16F10腫瘤中，作者觀察到活化的PD-1+ NK細胞的比例大大增加，這可能至少部分解釋了抗腫瘤作用的持久性。B16F10腫瘤接種于Batf3?/?、Rag1?/?和野生型小鼠的免疫細胞組成。這些結果使作者推測，DCP-IL-12/FLT3L的抗腫瘤活性依賴于內源性cDC1，而不需要T效應細胞的殺腫瘤功能。

7. 腫瘤反應依賴于IFN γ，不依賴于CD8+ T細胞

        為了進一步了解T細胞參與腫瘤對DCP-IL-12/FLT3L的反應，作者在B16F10腫瘤小鼠中進行了細胞耗盡和細胞因子中和研究（圖4i）。與Rag1?/?小鼠的研究結果一致，消除CD8+ T細胞并不影響腫瘤對DCP-IL-12/FLT3L的反應，值得注意的是，同時消除CD8+ T細胞、CD4+ T細胞和NK1.1+ NK細胞只能適度地挽救腫瘤生長（圖4j）。相比之下，中和IFNγ完全恢復腫瘤生長，而使用集落刺激因子1受體（CSF1R）抗體消耗TAM部分恢復腫瘤生長。值得注意的是，CSF1R不影響腫瘤和tdLN中的cDC數量，這與CSF1R?/?小鼠的研究結果一致。鑒于流式細胞術分析捕獲了相對細胞比例，作者使用非競爭抗體對腫瘤切片進行免疫熒光染色以獲得定量數據（圖4k， 1）。DCP-IL-12/FLT3L增加F4/80+ TAM，這一反應被CSF1R阻斷和IFNγ中和所消除，但不被T細胞和NK細胞消除所消除。此外，DCP-IL-12/FLT3L增加了CD8+和總CD3+ T細胞，但消除CD8+ T細胞并沒有減少總CD3+ T細胞數量，提示CD3+CD8?T細胞代償性浸潤腫瘤。有趣的是，CD8+T細胞消除增加了NK細胞和tam，即使在CD8+和CD4+ T細胞和NK細胞聯合消除后，它們仍然升高。在一項獨立研究中，單獨消除CD4+ T細胞或NK1.1+ NK細胞不會損害腫瘤對DCP-IL-12/FLT3L治療的反應，并且破壞CD4+ T細胞與總CD8+ T細胞和活化（IFNγ+或GZMB+） CD8+ T細胞的代償性增加有關。總的來說，這些發現表明B16F10腫瘤對DCP-IL-12/FLT3L的反應嚴格依賴于IFN Γ，涉及多種IFN Γ產生細胞，并且可能至少部分依賴于IFN Γ刺激的M1樣TAM的抗腫瘤活性。

圖5 細胞因子武裝DCPs在結直腸癌模型中提高了順鉑和PD-1阻斷的療效

        最后，為了探索IFNγ對B16F10黑色素瘤細胞的潛在直接影響，作者產生了ifngr1敲除的B16F10細胞。盡管觀察到腫瘤內CD8+ T細胞浸潤和活化增強（圖4n，o），但消除癌細胞對IFNγ的反應性足以否定DCP-IL-12/FLT3L在小鼠中的治療活性（圖4m）。綜上所述，作者的研究結果表明IFNγ是腫瘤抑制的關鍵介質，并強烈表明IFNγ的產生，而不是直接的CD8+ T細胞毒性，是DCP-IL-12/FLT3L治療反應所必需的。

8. 細胞因子武裝的DCPs提高了化學免疫治療的療效

        B16F10和MC38腫瘤表現出快速的生長動力學，這使得晚期腫瘤治療干預的評估復雜化。為了減緩MC38腫瘤的生長，作者用單劑量順鉑（一種用于結直腸癌治療的化療藥物）對MC38荷瘤小鼠進行預處理。隨后在第11天和第13天注射DCP-IL-12/FLT3L，從第14天開始注射PD-1阻斷抗體，每周兩次（圖5a）。雖然順鉑和抗PD-1聯合使用延遲了腫瘤生長，但在順鉑中加入DCP-IL-12/FLT3L可改善抗腫瘤反應，PD-1阻斷可進一步改善這種反應（圖5b）。聯合治療（順鉑，DCPs，抗PD-1）導致8只小鼠中的3只腫瘤消退或穩定（第27天和第11天），而其他組中所有腫瘤進展（圖5c）。DCP-IL-12/FLT3L聯合順鉑增加了造血細胞、CD8+和CD4+ T細胞在腫瘤內的浸潤，不依賴于PD-1阻斷（圖5d和擴展數據圖8b）。值得注意的是，大多數T細胞表現出非耗盡的激活表型。此外，體外再刺激實驗顯示，在接受完整治療方案的小鼠腫瘤中，CD8+ T細胞中IFNγ、GZMB和TNF的表達增強，CD4+ T細胞中IFNγ的表達升高（圖5e），這可能解釋了PD-1阻斷的附加益處。相反，用順鉑和抗PD-1治療的小鼠腫瘤內CD8+或CD4+ T細胞未升高，主要表現為衰竭表型。這些數據表明，細胞因子武裝的DCPs提高了結直腸癌模型的化學免疫治療效果。

9. 細胞因子武裝DCPs增加腫瘤模型中T細胞受體的多樣性

        作者通過T細胞受體β （TCRβ）的批量測序來檢測MC38腫瘤中的T細胞多樣性。作者觀察到接受DCP-IL-12/FLT3L的腫瘤的T細胞庫具有更高多樣性的趨勢，如更多的獨特克隆型所示（圖5f）。有趣的是，如無監督k均值聚類所示，接受DCP-IL-12/FLT3L治療的小鼠腫瘤中的T細胞在其TCR中的V基因使用方面具有顯著的相似性（圖5g）。這些發現表明，DCP-IL-12/FLT3L促進T細胞的擴增，并對MC38腫瘤相關抗原具有共同的特異性。

圖6 細胞因子武裝的DCP在兩種基因工程肝癌模型中均有效

        作者探索DCPs是否在兩種通過流體動力尾靜脈注射（HDTVi）致癌質粒獲得的基因工程肝癌模型中也有效。在第一個模型中，在肝細胞中激活KrasG12D癌基因并缺失Trp53可誘導具有肝細胞癌和膽管癌特征的多灶性肝臟腫瘤。KrasG12D； Trp53?/?腫瘤建立了免疫抑制和幾乎免疫荒漠的TME，并表現出侵襲性生長模式，小鼠中位生存期約為30天。單用抗PD-1、順鉑聯合抗PD-1或DCP-IL-12/FLT3L聯合順鉑和抗PD-1治療腫瘤啟動小鼠（圖6a）。與其他治療相比，DCP-IL-12/FLT3L顯著延長了生存期（圖6b）。值得注意的是，盡管從腫瘤誘導到終止的平均時間較長，但這些小鼠的大腫瘤較少（圖6c）。

        在兩項獨立研究中，作者分析了固定時間點（腫瘤發生后第23天）的肝臟。此時，三聯組小鼠的宏觀肝臟腫瘤數量大幅減少，11只小鼠中有4只無腫瘤（圖6d-f），與生存研究結果一致。肝實質免疫熒光染色顯示，與其他治療相比，大多數接受DCP-IL-12/FLT3L治療的小鼠的CD8+和CD4+ T細胞密度增加。作者還在分析的同一時間點（第23天）用流式細胞術檢測免疫細胞參數。DCP-IL-12/FLT3L增加了肝實質中的CD8+和CD4+ T細胞，無論是CD45+造血細胞的比例（圖6g）還是絕對細胞計數（圖6h）。此外，DCP-IL-12/FLT3L增加了CD44+CD62L?CD8+和CD4+ T效應細胞（圖6i）和IFNγ+ CD8+ T細胞（圖6j，k）。在肝引流淋巴結和脾臟中也觀察到更高比例的CD44+CD62L?CD8+ T效應細胞（圖6l）。

        然后，作者采用了基于HDTV的Myc驅動和Trp53缺失肝癌模型，該模型比KrasG12D； Trp53?/?模型發生的腫瘤更少。Myc； Trp53?/?腫瘤具有肝細胞癌的特征，具有功能失調的DC，并且對免疫檢查點阻斷具有抗性。單用抗PD-1、順鉑聯合抗PD-1或DCP-IL-12/FLT3L聯合順鉑和抗PD-1治療腫瘤啟動小鼠（圖6）。在該模型中，DCP-IL-12/FLT3L達到了100%的生存率，優于其他治療組的生存率（圖6n）。此外，在固定時間點（腫瘤發生后第21天）分析的獨立小鼠隊列顯示，DCP-IL-12/FLT3L組的6只小鼠中有5只沒有宏觀腫瘤的證據，而其他組中至少有50%的小鼠有腫瘤。流式細胞術分析顯示，在接受DCP-IL-12/FLT3L治療的小鼠中，CD4+（而非CD8+） T細胞比例增加；這種反應與肝引流淋巴結和脾臟中CD4+和CD8+ T效應細胞比例升高有。總之，在兩種侵襲性肝癌模型中，細胞因子武裝DCPs通過誘導產生IFN γ的T細胞、降低腫瘤多樣性和延長生存期來改善腫瘤對順鉑和抗PD-1的反應。

10. 細胞因子武裝的DCPs在膠質瘤模型中與CAR-T協同作用

        CAR-T是具有工程腫瘤特異性的T細胞。雖然CAR-T可以識別并殺死表達靶向抗原的癌細胞，但其在實體腫瘤中的治療效果受到抗原異質性和免疫抑制TME的限制。作者使用了侵襲性SB28小鼠膠質瘤模型，它概括了人類膠質母細胞瘤的關鍵特征，免疫沉默，對免疫檢查點阻斷無反應。作者使用了針對GD2的CAR-T， GD2是一種在人類膠質瘤亞群中表達的雙胞脂苷，也是一種經臨床驗證的CAR-T靶標。GD2+ SB28膠質瘤細胞是通過用編碼GD2合成酶、GD2S和GD3S的lv轉導親本細胞系產生的。抗GD2 CAR-T在體外有效殺傷GD2+細胞，但不殺傷GD2 - SB28細胞。

圖7 細胞因子武裝的DCP在兩種基因工程肝癌模型中均有效

        作者在小鼠腦內接種SB28-GD2細胞，并用DCP-IL-12/FLT3L、抗GD2 CAR-T或兩者的組合處理它們（圖7a）。通過縱向實時成像分析監測腫瘤進展。接受DCP-IL-12/FLT3L和CAR-T聯合治療的小鼠存活時間明顯長于單獨接受任何一種細胞治療的小鼠（圖7b）。雖然DCP-IL-12/FLT3L或CAR-T單藥治療中度延遲腫瘤進展，但CAR-T隊列中除一只小鼠外，所有小鼠均出現進展性疾病（圖7c，d）。相反，聯合治療在5只小鼠中有4只小鼠腫瘤消退，直到研究結束（腫瘤接種后第71天）仍無腫瘤。

        上述研究使用了表達IL-12或FLT3L的DCPs混合物。然后，作者使用雙頻IL-12/FLT3L LV單導的DCPs重復了膠質瘤研究。與上述結果一致，DCP-IL-12/FLT3L + CAR-T在8只小鼠中根除了6只小鼠的腫瘤（1只小鼠在無腫瘤時被殺死），而其他組的所有小鼠都出現了進行性疾病（圖7e-g）。死后大腦免疫熒光染色顯示，通過活體成像評估為無腫瘤的小鼠中未檢測到膠質瘤細胞；有趣的是，大量的CD3+ T細胞浸潤持續存在于腫瘤完全消退的部位。因此，DCP-IL-12/FLT3L與GD2特異性CAR-T協同作用可根除小鼠大部分顱內膠質瘤。

        小鼠DCPs的臨床前療效促使作者測試人類臍帶血CD34+ HSPCs是否支持DCPS分化。在1周內，在FLT3L、IL-3、IL-6、TPO和小分子UM729存在下培養的CD34+細胞顯著擴增（圖8 e），并獲得更分化的祖細胞狀態，包括常見的髓系祖細胞、粒細胞-單核細胞和DC祖細胞、單核細胞-DC祖細胞（MDPs）、CDPs和前DCs。雖然表達CDP標記物的細胞頻率可以忽略不計（<0.1%），但培養的細胞含有相當大比例（約7%）的MDPs。鑒于MDPs是單核抗原呈遞細胞（APCs）的前體，包括CDPs、cDC1和cDC2，作者研究了含有MDPs的細胞群（鑒定為Lin-CD34+CD115+，暫時稱為DCPs）產生cDCs的能力。在第7天，Lin-CD34 +CD115+ DCPs表達了CDPs和MDPs之間共享的標記（例如，CD117/KIT， CD135和CD45RA；圖8 b）。這些細胞可以從臍帶血和動員外周血（MPB）中獲得，MPB是CD34+ HSPCs41的臨床來源。然而，臍帶血比MPB產生更多的DCPs（圖8c，d）。臍帶血和MPB衍生的DCPs都可以被表達dLNGFR的LV有效轉導（圖8e），這表明LV轉導在該細胞群中是可行的。

        為了研究Lin-CD34+CD115+ DCPs的APC分化能力，作者從7天臍帶血或MPB培養中分離出Lin-CD34+CD115+ DCPs，并在cDC培養基（含FLT3L、GM-CSF、SCF和IFNα）中培養。作為對照，作者模擬了第7天的細胞，其中大多數是CD115?。1周后（第14天），Lin-CD34+CD115+細胞有效地分化為APC，包括單核細胞、cDC1、cDC2和未成熟的DC，其他細胞類型的貢獻較小，而是在模擬分類細胞培養中擴增（圖8f）。這些結果表明Lin-CD34+CD115+細胞可以作為人DCPs發揮作用。

圖8 人HSPC是具有抗原呈遞能力的DCP的來源

        接下來，作者評估了人類DCPS衍生細胞（稱為DCPs后代）和moDC的抗原呈遞能力。作者使用巨細胞病毒（CMV）蛋白PP65和HLA - A2限制性CMV特異性T細胞。作者研究了三種抗原呈遞途徑:（1）呈遞PP65495-504肽負載的HLA-A2，模擬直接呈遞；（2）交叉呈遞由天然PP65蛋白內源性加工而成的PP65495-504肽；（3）細胞外囊泡攜帶PP65495-504 HLA-A2對DC進行抗原交叉修飾。T細胞與先前暴露于PP65495-504肽、PP65蛋白或裝載PP65495-504的細胞外囊泡的DCPS子代或moDCs共培養，分別測定直接呈遞、交叉呈遞和交叉呈遞。對于變裝，作者使用從HLA-A2+或陰性的人類黑色素瘤細胞中分離的細胞外囊泡和從HLA-A2陰性供者獲得的DC，前提是HLA-A2陰性的細胞外囊泡不會通過變裝激活HLA-A2限制性T細胞。在每種情況下，DCPS后代比moDCs更有效地激活cmv特異性T細胞，盡管T細胞的激活程度因供體而異（圖8g – 1）這些結果表明，人類DCPs，鑒定為Lin-CD34 +CD115+細胞，可以分化為具有抗原呈遞能力的細胞后代。

結論

        這一發現表明，DCPs部署IL-12可能直接增強CAR-T細胞。或者，DCPs可能協調IFN γ依賴的內源性免疫反應，消除逃避CAR-T細胞識別和殺死的癌細胞。這些結果，再加上開發人類DCPs樣細胞的可行性，激發了基于抗原不可知的DCPs治療的進一步臨床前研究。

實驗方法：

        逆轉錄病毒載體的設計和生產，細胞培養，小鼠骨髓細胞的分離，小鼠DCPs的生成， DCPs的分化，小鼠moDCs和CDC1樣細胞的生成，OT-I和OT-II T細胞與載抗原cDC1樣細胞共培養，小鼠DCP和moDCs與LVs的轉導，CAR-T細胞產生，CAR-T細胞殺傷試驗，流式細胞術分析，免疫熒光染色，人T細胞刺激試驗，scRNA-seq，整體TCR測序。

參考文獻：

        Dong, W., Fekete, A., Chen, X., Liu, H., Beilhartz, G. L., Chen, X., Bahrampour, S., Xiong, Y., Yang, Q., Zhao, H., Kong, T., Morioka, M. S., Jung, G., Kim, J. E., Schramek, D., Dirks, P. B., Song, Y., Kim, T. H., He, Y., Wanggou, S., … Huang, X. (2023). A designer peptide against the EAG2-Kvβ2 potassium channel targets the interaction of cancer cells and neurons to treat glioblastoma. Nature cancer, 4(10), 1418–1436. https://doi.org/10.1038/s43018-023-00626-8