骨質疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種常見的全身性骨疾病，成骨細胞的程序性死亡與骨質疏松癥的發生發展密切相關。已有研究表明，c-fos可引起成骨細胞凋亡。此外，lncRNA在調節成骨細胞的生物學中起著普遍的作用。然而，lncRNA在成骨細胞死亡中與c-Fos相關的轉錄水平的確切作用和機制仍不確定。與正常成骨細胞相比，血清剝奪導致成骨細胞中轉錄因子c-Fos和凋亡相關Fas蛋白顯著上調。此外，與c-Fos相關的lncRNA GM15416表達顯著升高。c-Fos過表達導致下游Fas蛋白增加，進而導致成骨細胞凋亡，阻礙成骨。lncRNA GM15416表達減少導致c-Fos/Fas表達減少，從而阻礙成骨細胞凋亡，促進成骨。我們的研究結果表明lncRNA GM15416對成骨細胞凋亡具有抑制作用，是骨質疏松癥的預防因子。因此，GM15416成為與骨質疏松癥相關的重要lncRNA，并有望成為未來的治療靶點。本文于2023年11月發表于“International Journal of Biological Macromolecules”（IF=8.2）上。

技術路線：

結果：

1）成骨細胞凋亡促進骨質疏松

        為了研究細胞凋亡在骨質疏松癥中的作用，我們使用了Sham和OVX小鼠兩種動物模型。我們通過micro-CT和H&E染色的初步評估顯示，與假手術組相比，OVX組顯示骨小梁減少，脂肪細胞增加(圖1A、1B、1C)。OVX組中ARS和Von Kossa的表達水平顯著降低(圖1D, 1E)。Western blot驗證顯示，OVX組Bax水平顯著升高，Bcl2水平顯著降低。另一個關鍵的凋亡分子-caspase-3的水平顯著升高(圖1F, 1G)。為了促進體外成骨細胞凋亡模型的建立，我們在先前研究的基礎上采用了血清饑餓誘導模型。值得注意的是，誘導組細胞凋亡水平明顯升高。Bcl2表達降低，Bax、caspase-3、cleaved - caspase-3表達顯著升高(圖1H、圖1I)。

2）c-fos和Fas的升高與成骨細胞凋亡顯著相關

        為了建立c-Fos與骨質疏松之間更強的關聯，我們特意選擇了已被證實的凋亡關鍵分子Fas，并對Sham和OVX組進行了western blot分析。研究結果顯示，OVX組中c-Fos和Fas蛋白水平顯著增加(圖2A, 2B)。同樣，在體外實驗，觀察到SD組c-Fos和Fas蛋白水平顯著升高(圖2C, 2D)。隨后，我們進行了co-IP實驗來驗證c-Fos和Fas在MC3T3-E1細胞中的存在，從而表明兩者之間存在內在的相關性(圖2E)。在c-Fos敲除后，免疫熒光分析顯示，與NC組相比，si-Fos組的c-Fos熒光強度顯著降低(圖2F和2G)。si-Fos的體外驗證表明，Fos表達的減少與Fas水平的降低相對應，因此，這導致凋亡相關蛋白Bax和cleaved caspase-3的抑制以及Bcl2水平的部分恢復(圖2H-2I)。此外，敲除c-Fos后，細胞凋亡顯著減少(圖3A-3D)。以上結果表明，c-Fos通過作用于Fas誘導成骨細胞凋亡。

3）lncRNA GM15416在OVX小鼠和血清饑餓誘導的成骨細胞中高表達

        為了建立上述c-Fos基因之間的聯系，我們進行了生物信息學和數據庫比較的綜合分析，鑒定出15個與c-Fos相關的差異表達lncRNA。此外，對GM15416進行GSEA富集分析，以確定其參與凋亡途徑(圖3E-3G)。體內和體外實驗驗證結果顯示，血清饑餓誘導的成骨細胞中lncRNA GM15416的表達水平顯著升高(圖3H)。此外，OVX模型中GM15416的表達水平顯著超過其他14種lncRNA的表達水平(圖3I)。此外，我們評估了GM15416在OVX小鼠的7個器官中的表達水平，其中骨中GM15416的表達水平第二高(圖3J)。

4）GM15416通過c-fos/fas軸促進成骨細胞凋亡，導致成骨分化能力降低

        我們將通過分子對接和分子動力學模擬實驗來模擬lncRNA GM15416與c-Fos之間的關系。利用PyMOL，我們發現了蛋白與核酸CCCATCTGTCTTTCTGC之間的相互作用。在這些作用力的作用下，確定fos-核酸的得分為?291.81，表現出較好的性能(圖4A)。通過動態模擬，我們可以得出蛋白質和核酸在原有的結合構象上進行了優化，使得復合物的結合更加穩定(圖4B-4E)。此外，GM15416在細胞核內具有顯著的豐度(圖4F)。western blot分析表明，GM15416的體外下調導致c-Fos和Fas的表達水平降低，從而導致成骨細胞凋亡減少(圖4G, 4H)。抑制GM15416可顯著減少細胞凋亡(圖4I-4L)。

        為了研究c-Fos對GM15416的影響，我們進行了RIP實驗，發現c-Fos能夠拉下GM15416(圖5A)。此外，RNA下拉證實了相互作用，揭示生物素化的GM15416可以拉下c-Fos(圖5B)。TUNEL染色和流式細胞術結果顯示，GM15416過表達與成骨細胞凋亡增加有關。si-Fos的引入可以部分減輕GM15416誘導的細胞凋亡(圖5C-5F)。western blot分析顯示，GM15416過表達導致c-Fos和Fas表達水平上調，隨后導致細胞凋亡水平升高。Fos敲低后，凋亡蛋白Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3的表達水平下調(圖5G, H)。免疫熒光染色分析顯示GM15416過表達后c-Fos的相對熒光表達增加(圖5I, J)。為了確定GM15416在成骨分化過程中的作用，我們使用western blot分析評估了成骨分化基因Runx2、Opn和Osx的蛋白表達水平(圖5K, L)。結果顯示，GM15416過表達導致的成骨分化異常可以通過抑制c-Fos得到改善。ALP和ARS的染色數據表明，GM15416對成骨分化能力有負面影響，可通過抑制c-Fos部分恢復成骨分化能力(圖5M-5P)。這些實驗結果表明，GM15416可通過上調c-Fos和Fas誘導成骨細胞凋亡，導致成骨分化受損。

5）抑制GM15416可挽救c-Fos介導的成骨細胞凋亡和成骨分化功能障礙

        為了研究GM15416對c-Fos的影響，采用了c-Fos和敲除GM15416的共培養。TUNEL染色和流式細胞術結果顯示，GM15416敲低可有效減輕c-Fos過表達誘導的細胞凋亡(圖6A-6D)。通過免疫熒光染色和western blot分析初步證實c-Fos成功過表達。隨后，在功能驗證階段觀察到c-Fos過表達。隨著Fas表達的增加，凋亡誘導蛋白Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3的表達水平升高，Bcl2的表達水平降低。然而，與c-Fos過表達組相比，共培養組顯示出更高的細胞凋亡表達水平(圖6E-6H)。隨后，通過western blot分析評估成骨分化能力，研究GM15416基因敲低對成骨分化的影響。數據顯示，c-Fos過表達導致成骨分化能力降低，而GM15416的敲低部分減輕了上述損傷(圖6I, J)。應用ALP和ARS染色技術評估成骨礦化能力表明，c-Fos的上調會影響成骨礦化，而GM15416的下調會增強成骨礦化(見圖6K-6N)。這些發現證明GM15416抑制可通過調節c-Fos和Fas的表達水平，減輕成骨細胞凋亡，增強成骨分化功能。

6）LncRNA GM15416減輕OVX小鼠骨丟失

        我們評估了GM15416在體內減輕骨質流失的治療潛力。與OVX + si-NC組相比，OVX + si-GM15416組的骨礦物質密度(BMD)、骨體積分數(BV/TV)和小梁數(Tb.N)水平明顯較高，小梁間隙(Tb.Sp)水平較低(圖7A, B)。此外，si-GM15416顯著增加骨小梁體積，促進骨形成過程。H&E圖像的組織學檢查進一步證實了這些結果(圖7C)。western blot結果顯示，與OVX + si-NC組相比，si-GM15416組對細胞凋亡有明顯的抑制作用。此外，在OVX + si-GM15416組中，Fos和Fas蛋白各自的表達水平下調(圖7D, E)。此外，小鼠股骨的免疫組織化學圖像(圖7F)顯示，OVX + si-GM15416組與OVX + si-NC組相比，Runx2、Osx和Opn的表達水平更高。相反，OVX + si-GM15416組Fos、Fas、Bax、cleaved-caspase-3、Caspase-3的表達降低。western blot分析結果還顯示，與對照組相比，GM15416敲低后成骨分化標志物Runx2、Osx、Opn的表達均有顯著改善(圖7G, H)。此外， si- GM15416組ARS和Von Kossa的相對表達水平顯著高于si-NC組(圖7I, J)。綜上所述，上述研究結果證實了GM15416通過c-Fos/Fas途徑誘導成骨細胞凋亡，最終導致骨質流失，如圖7K所示。

結論：本研究提示lncRNA GM15416通過特異性影響c-Fos/Fas通路，對成骨細胞凋亡具有抑制作用，并可作為預防骨質疏松的因子。因此，GM15416成為與骨質疏松癥相關的重要lncRNA，并有望成為未來的治療靶點。

實驗方法：OVX動物模型的建立，qPCR，Micro-CT，HE染色，免疫組化，免疫熒光，茜素紅染色，堿性磷酸酶染色，Masson染色，Von Kossa染色，流式，TUNEL染色，WB，FISH，RIP，RNA pull down，Co-IP，分子對接。

參考文獻：Zhao D, He J, Zhao X, Sheng X, Feng Z, Wang X, Zhang C, Wang S, Geng B, Xia Y. A novel lncRNA GM15416 regulates osteoblast apoptosis and differentiation through the c-Fos/Fas axis and mitigates osteoporosis. Int J Biol Macromol. 2023 Nov 2;254(Pt 2):127824. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127824.