索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，在包括胃癌（GC）在內的多種癌癥中作為鐵死亡誘導劑具有重要的抗腫瘤作用。然而，索拉非尼作為鐵死亡誘導劑的作用最近受到了質疑。有關鐵死亡與ATF2關系的信息非常有限，而ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用也尚未研究。因而，本研究探討了GC中ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用及其分子機制。作者發現索拉非尼激活ATF2的表達，并進一步促進HSPH1的表達，減少SLC7A11蛋白的降解，從而導致對脂質過氧化的保護。在小鼠中，敲除ATF2能有效提高索拉非尼的敏感性。本文于2023年2月發表在《Redox Biology》IF: 11.4期刊上。
技術路線

主要實驗結果
1、ATF2在胃癌中表達上調，預示預后不良
       TCGA數據顯示ATF2在胃癌組織中的高表達（圖1A），ATF2在GC細胞系中的表達也顯著高于非惡性細胞系（圖1B），在12對臨床樣本中，ATF2在胃癌組織中的表達也顯著高于癌旁（圖1C）。在107例GC組織和22例癌旁組織的GC芯片中檢測了ATF2的表達（圖1D），61.7%的GC組織高表達ATF2（圖1E），并且ATF2高表達的GC患者生存期更短（圖1F）。以上表明ATF2在胃癌中表達上調，預示預后不良。

圖1 ATF2在胃癌中表達上調，預示預后不良

2、ATF2敲除抑制GC細胞惡性表型
       如圖2所示，過表達ATF2促進細胞增殖、遷移和侵襲，敲低ATF2則結果相反。表明ATF2促進GC惡性表型。

圖2 ATF2敲除抑制GC細胞惡性表型

3、索拉非尼誘導GC細胞鐵死亡并激活ATF2表達
       由于先前的研究表明索拉非尼誘導的鐵死亡中存在不確定性，所以作者首先研究了索拉非尼是否會誘導GC細胞的鐵死亡。如圖3A所示，10 μM索拉非尼作用24 h后，AGS和MGC803細胞形態均縮小、變圓、排列疏松，而與鐵死亡抑制劑共同處理可以部分逆轉這些變化。與對照組相比，索拉非尼治療導致總細胞ROS和脂質ROS增加（圖3B-3C）。此外，用索拉非尼孵育導致MDA急劇增加而GSH下降，而這種影響被fer-1有效抑制（圖3D和E）。以上結果表明索拉非尼誘導GC細胞鐵死亡。

圖3索拉非尼誘導AGS和MGC-803細胞鐵死亡

       鑒于鐵死亡與線粒體功能密切相關，接下來檢測線粒體膜電位（MMP）和形態學的變化。JC-1染色結果顯示，與對照組相比，索拉非尼治療顯著降低MMP（圖4A），透射電鏡顯示，索拉非尼處理的MGC803細胞線粒體嵴明顯減少或缺失，線粒體膜密度增加（圖4B）。這些結果也表明索拉非尼可以誘導GC細胞的鐵死亡。作為一種關鍵的應激反應轉錄因子，ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡反應中的表達變化仍然未知。如圖4C所示，索拉非尼處理增加ATF2的表達，尤其是磷酸化形式。值得注意的是，免疫熒光顯示，索拉非尼刺激后 ATF2 在細胞核中的表達量更高（圖4D）。因此，索拉非尼誘導的鐵變態反應可能會促進 ATF2 的核轉位并增強 ATF2 在 GC 細胞中的轉錄活性。

圖4索拉非尼治療增加GC細胞中ATF2的表達并促進其核易位

4、ATF2敲除抑制索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡
       如圖5所示，為了解ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用，作者干預ATF2的表達水平并評估它們對鐵死亡的影響。與載體組相比，ATF2過表達導致AGS細胞中索拉非尼的IC50值升高，而ATF2敲低導致MGC803細胞中索拉非尼的IC50值降低（圖5A）。索拉非尼治療和ATF2敲低均升高了細胞總ROS和脂質ROS，ATF2敲低導致AGS細胞中ROS的進一步升高，而ATF2過表達抑制了索拉非尼在MGC803細胞中誘導的升高（圖5B-C）。在索拉非尼處理的GC細胞中，ATF2過表達導致MDA降低，GSH升高，而ATF2敲低則顯示相反的結果（圖5D-E）。TEM結果顯示索拉非尼治療后，ATF2敲低的GC細胞線粒體減少，膜密度增加，嵴退化，這種作用部分被ATF2過表達逆轉（圖5F）。這些發現表明ATF2過表達抑制索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡。

圖5 ATF2敲除抑制索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡

5、ATF2在GC細胞中激活HSPH1的轉錄
       為進一步闡明其潛在機制，進行RNA-seq和ChIP-seq分析，以確定全基因組的DNA結合位點和ATF2的潛在轉錄靶點。如圖6A所示，RNA-seq分析顯示，與對照組相比，MGC803細胞中ATF2基因敲除后，有1059個基因上調，370個基因下調。重要的是，RNA-seq數據的通路富集分析表明，ATF2基因敲除會顯著影響鐵死亡通路（圖6B）。接下來，ChIP-seq共鑒定出24119個峰，對應3641個RefSeq基因，其中2.88%位于啟動子-轉錄起始位點（圖6C）。在染色體上觀察到了不同的峰值，并掃描了峰值之間共享的motif（圖6D和E）。

圖6利用RNA-seq和ChIP-seq技術鑒定ATF2的全基因組DNA結合位點和轉錄靶點

       然后，對RNA-seq和ChIP-seq數據進行交叉分析，篩選出222個ATF2直接調控的候選轉錄靶點（圖7A）。其中，HSPH1在ATF2敲低后顯著下調（圖7B）。此外，在TCGA數據集中，HSPH1在GC中的表達與ATF2呈顯著正相關（圖7C）。如圖7D所示，ChIP-seq數據顯示HSPH1啟動子區域存在顯著的ATF2結合峰。因此，作者推測HSPH1可能是ATF2的潛在靶基因。WB分析結果顯示，ATF2過表達后，HSPH1增加，而ATF2敲除后，HSPH1減少（圖7E）。此外，ChIP-qPCR進一步證實ATF2可與HSPH1的啟動子區域結合（圖7F）。這些數據表明ATF2可以通過與HSPH1啟動子結合來激活HSPH1的表達。

圖7 ATF2結合HSPH1啟動子激活其轉錄

6、HSPH1與SLC7A11在GC中相互作用并增加其穩定性
       鑒于多項研究報道了熱休克蛋白在鐵死亡反應中的突出作用，作者試圖確定 HSPH1是否會影響SLC7A11在GC中的表達。首先查詢GeneMANIA數據庫，預測并顯示HSPH1與SLC7A11之間潛在的相互作用（圖8A）。為驗證這一預測，進行co-IP實驗，確定HSPH1與SLC7A11存在物理相互作用（圖8B）。采用siRNA敲除HSPH1的表達（圖8C），并將HSPH1 siRNA轉染到ATF2穩定過表達的AGS細胞中。有趣的是，觀察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表達水平，但沒有降低mRNA水平（圖8D）。因此，進行CHX追逐試驗，以確定在是否敲除HSPH1的情況下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明，與對照組相比，抑制HSPH1會加速AGS細胞中SLC7A11蛋白的降解（圖8E）。這些結果表明，HSPH1可以與SLC7A11相互作用，并至少部分地通過增加SLC7A11蛋白的穩定性來增加其表達。敲除HSPH1可部分消除ATF2過表達對細胞ROS和脂質ROS的影響（圖8F和G）。同樣，聯合轉染HSPH1 siRNA能顯著逆轉ATF2過表達對鐵變態細胞死亡中細胞MDA和GSH水平的影響（圖8H和I）。這些結果為ATF2通過HSPH1調控索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡提供了證據。

圖8 HSPH1與SLC7A11相互作用，提高其在GC中的穩定性

7、體內ATF2敲低增加GC對索拉非尼的敏感性
       最后，為評估ATF2單獨和聯合索拉非尼對體內GC的影響，建立裸鼠異種移植模型（圖9A）。穩定ATF2敲除細胞形成的腫瘤始終比對照GC細胞形成的腫瘤更小更輕，這表明ATF2敲除能有效抑制體內腫瘤的生長（圖9B）。此外，經索拉非尼治療后，皮下腫瘤的體積和重量均顯著減少（圖9C和D）。也就是說，ATF2敲除聯合索拉非尼治療對腫瘤生長的抑制作用最強。為更好地觀察潛在的死亡，皮下腫瘤切片被4-HNE染色，IHC染色顯示，sh-ATF2 +索拉非尼組的4-HNE 表達量最高（圖9E）。因此，ATF2基因敲除可增強索拉非尼在體內對GC的抗腫瘤作用。

圖9體內ATF2敲低增加GC對索拉非尼的敏感性

       總之，在本研究中，作者發現索拉非尼激活ATF2的表達，并進一步促進HSPH1的表達，減少SLC7A11蛋白的降解，從而導致對脂質過氧化的保護（圖10）。因此，以ATF2/HSPH1軸為靶點來增強索拉非尼誘導的鐵死亡代表了一種有吸引力的GC治療策略。

圖10 圖像摘要

實驗方法
胃癌臨床樣本采集，細胞培養和轉染，WB，RT?PCR，IHC，細胞生長曲線，IC50檢測，Transwell遷移和侵襲，Calcein-AM/PI染色，ROS和脂質過氧化檢測，MDA和GSH檢測，線粒體膜電位檢測，透射電鏡TEM，RNA-seq，ChIP-seq，共免疫沉淀（Co-IP），蛋白穩定性CHX實驗，小鼠模型，
參考文獻
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59:102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564. Epub 2022 Dec 2. PMID: 36473315; PMCID: PMC9723522.