摘要
       Netrin-1 作為一種促腫瘤機制在癌癥中上調。在這里，我們描述了大多數人類子宮內膜癌 (EC) 中 netrin-1 的上調，并證明使用抗 netrin-1 抗體 (NP137) 阻斷 netrin-1 可有效減少 EC 小鼠模型中的腫瘤進展。接下來，我們在一項由 14 名晚期 EC 患者組成的 I 期試驗中檢查了 NP137 作為一種首創的單一藥物的療效。我們觀察到 8 例疾病穩定和 1 例 RECIST v.1.1 客觀緩解。為了評估 NP137 的作用機制，對小鼠腫瘤基因進行了分析，我們觀察到，除了誘導細胞死亡之外，NP137 還抑制上皮間質轉化 (EMT)。通過對 NP137 試驗中 EC 患者的治療前和治療中配對活檢進行批量 RNA 測序、空間轉錄組學和單細胞RNA-seq，我們注意到腫瘤 EMT 的凈減少。這與免疫浸潤的變化以及癌細胞與腫瘤微環境之間相互作用的增加有關。鑒于 EMT 在抵抗當前護理標準中的重要性，我們在 EC 小鼠模型中表明，NP137 與卡鉑-紫杉醇的組合優于單獨的卡鉑-紫杉醇。我們的結果確定 netrin-1 阻斷是一種觸發腫瘤減滅和 EMT 抑制的臨床策略，從而有可能減輕對標準治療的耐藥性。
       該研究于2023年8月發表在《Nature》，IF：64.8。
技術路線

結果
1、Netrin-1 和子宮內膜腺癌
       我們通過逆轉錄定量 PCR (RT-qPCR) 分析了 72 個人類子宮內膜腫瘤隊列中 netrin-1 的表達。netrin-1 在子宮內膜腺癌 (EC) 中顯著上調，而級別或亞型沒有具體變化。其主要受體 UNC5B 在腫瘤組織中的表達量也高于正常子宮內膜。通過免疫組織化學 (IHC) 監測大多數子宮內膜腫瘤的 Netrin-1（和 UNC5B）陽性率。
       因此，我們轉向使用基因工程、時間控制的 Pten f/f 缺失小鼠模型（即他莫昔芬誘導的 CAG-CreERT+/- 啟動子）來概括 EC 發展的臨床前模型，該模型已被證明可以發展 EC原位快速發生，以及甲狀腺增生（圖1a）。因此，我們用 NP137（10 mg kg-1，每周 3 次）治療對照小鼠和 Pten 缺失小鼠 3-4 周，并分析 netrin-1 表達和腫瘤進展。如圖1b、c所示，在Pten缺失后，netrin-1在小鼠腫瘤中上調，而在NP137治療后這種上調有所減少。有趣的是，NP137 與子宮內膜腫瘤的發展減少和生存增加相關（圖 1d；請注意，Pten 刪除后 7 周后研究沒有擴展，因為大多數小鼠表現出呼吸困難或其他癥狀。由于甲狀腺腫瘤的發展而引起的疾病）。病理學家觀察到 NP137 治療后癌細胞數量減少（圖 1e），子宮內膜組織更健康（圖 1f）。同樣，在接受 NP137 治療的小鼠的甲狀腺中也觀察到了抗腫瘤活性。這些結果表明，針對 EC 中的 netrin-1 可以抑制腫瘤進展。

2、EC 患者的客觀反應
       基于先前的結果表明 netrin-1 阻斷是一種可行的癌癥治療策略，我們開發了一種 netrin-1 阻斷抗體用于臨床使用，并正在進行 I/II 期評估。我們從正在進行的 1 期研究中提取了 14 名 EC 患者的療效數據。在這項研究中，NP137 作為單一療法每 2 周 (Q2W) 給藥一次，直至臨床/放射學進展。如圖 2a 和擴展數據表 1a 所示，沒有觀察到劑量限制性毒性，超過一半的患者的疾病控制為最佳反應。此外，一名患有晚期 EC 的 74 歲女性患者出現了 RECIST1.1 定義的部分緩解。該患者的最初診斷顯示子宮內膜樣起源、微衛星穩定表型以及 CK7、PAX8 和雌激素受體表達，但不表達 CK20 或孕激素受體。在給予 NP137 之前，她已接受多次治療嘗試，包括輔助放療和卡鉑-紫杉醇，隨后使用 lurbinectedin 作為轉移性疾病的一線治療，并第二次嘗試使用卡鉑-紫杉醇，但盡管進行了這些治療，肝轉移仍出現進展。
       納入時進行的正電子發射斷層掃描-計算機斷層掃描 (PET-CT) 掃描證實了氟脫氧葡萄糖的強烈攝取（在 C1D1 之前）。她接受了 14mg/kg 靜脈注射 NP137 Q2W，并在第 6 周（即 NP137 第 3 個周期后）接受了 PET-CT 掃描，根據 RECIST v.1.1 顯示部分緩解，目標肝臟病變減少了 51%（圖 2b、c)。 3 個月時 PET-CT 掃描證實部分緩解（圖 2c），然后在 6 個月時再次確認，此時目標病灶尺寸縮小達到 55%。該患者最終在 NP137 17 個周期后出現疾病進展，并繼續接受額外治療，包括來曲唑 A、免疫療法和他莫昔芬，但沒有出現額外的客觀反應。

3、Netrin-1 阻斷抑制腫瘤 EMT
       為了深入了解 netrin-1 阻斷與腫瘤生長抑制之間的聯系，我們首先根據 netrin-1 阻斷的假設作用模式分析了腫瘤生長抑制是否與 Pten f/f 腫瘤中的腫瘤細胞死亡相關用NP137處理。如圖 3a、b 所示，通過 IHC 對活性 caspase-3 進行測量，NP137 增加了癌癥細胞凋亡。接下來，我們對經過 NP137 治療的 Pten f/f 小鼠腫瘤與未經治療的 Pten f/f 小鼠腫瘤進行了 RNA 測序。在 NP137 給藥后調節的途徑/基因中，我們注意到治療后 EMT 相關基因的減少。幾項體外研究表明 netrin-1 參與 EMT，通常與 PI3K/AKT 通路相關，該通路在子宮內膜癌中經常發生改變。然后我們研究了 NP137 是否可能影響 Pten f/f 小鼠模型中的腫瘤 EMT。我們首先評估了對照組與 NP137 治療腫瘤中 EpCAM 上皮標志物的表達，并觀察到該上皮標志物在 NP137 治療腫瘤中顯著增加（圖 3c，d）。為了更全面地了解腫瘤基因表達，我們利用了常用的泛癌 EMT 特征，可用于確定 EMT 評分。我們觀察到，NP137治療降低了EMT評分（圖3e），與間充質基因表達減少和上皮基因表達增加相關（圖3f）。這些臨床前數據支持這樣的觀點，即 netrin-1 阻斷對腫瘤細胞具有雙重作用：觸發癌細胞死亡和抑制 EMT 特征，使整體 NP137 治療的腫瘤更具上皮性。
       接下來我們確定在臨床前模型中觀察到的 EMT 特征的抑制是否也發生在接受 NP137 治療的患者中。在 NP137 1 期試驗中，在上述 EC 患者中，在納入時 (C1D1) 以及使用抗 netrin-1 化合物治療 1 個月后（即在第三次輸注 NP137 之前 (C3D1) 收集配對活檢））。對 12 個配對的治療前和治療中活檢組織成功進行了批量 RNA 測序（補充表 1b），如圖 4a、b 所示，發現兩次 NP137 注射足以引發胰腺癌 EMT 評分顯著下降如上所述，表明在用 NP137 治療 1 個月后，患者的腫瘤總體上皮表型更多。經 NP137 治療的患者腫瘤樣本中 EpCAM IHC 染色的增加證實了向上皮表型的轉變（圖 4c、d）。我們還觀察到共表達全細胞角蛋白和波形蛋白的腫瘤細胞比例下降（圖4e）。
       有趣的是，在分析基線和治療活檢之間 EMT 評分的變化時，我們觀察到，以疾病進展作為對 NP137 最佳反應的患者樣本（第 6 周首次評估時疾病進展）未能顯示 EMT 評分的變化。相反，在疾病控制的患者樣本中，EMT 評分出現統計學顯著下降。
       為了更正式地證明患者接受 NP137 治療后出現的 EMT 評分的大量變化專門發生在癌細胞中，作為第一種方法，我們使用了與福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織兼容的 10x Visium 空間基因表達系統。對兩名 EC 患者的兩對 C1D1/C3D1 FFPE 切片進行了分析，并在病理學家選擇的感興趣區域中進行了空間基因表達譜分析，其中H&E染色只能識別癌細胞。在這兩種情況下，與 C1D1 相比，C3D1 的 EMT 評分均大幅下降（圖 4f）。因此，在患者中，用 NP137 治療 1 個月后，與治療前狀態相比，剩余的癌細胞表現出減少的 EMT 特征。
       為了將這些研究擴展到單細胞水平，我們直接對 NP137 試驗中納入時和 1 個月后獲得的新鮮活檢組織（C1D1，9,216 個細胞）進行了 3′?單細胞 RNA 測序（10x Genomics Next GEM 3′?試劑盒）來自晚期 EC 患者（圖 5a）的治療結果（C3D1，7,159 個細胞）。無監督聚類顯示存在不同的細胞群，包括腫瘤細胞（表達 EpCAM、PGR 和 TFF3 - ECs21 的所有標記）、免疫細胞（以 CD45 (PTPRC) 表達標記）、癌癥相關成纖維細胞（CAF，以 αSMA (ACTA2 標記)）和內皮細胞（PECAM1 陽性）（圖 5b）。NP137 治療導致腫瘤細胞區室顯著減少（圖 5b、c）。
       經過兩個周期的 NP137 治療后，抗 netrin-1 治療后的腫瘤細胞比例降低了 3.19 倍。有趣的是，除了癌細胞的凈減少外，我們還注意到整個腫瘤區室的 EMT 評分在統計上顯著下降，表明與 NP137 治療相關的總體上皮表型更多（圖 5d）。我們還僅在腫瘤細胞中進行了無偏差異表達和通路分析。值得注意的是，EMT 是最重要的術語，在暴露于 NP137 后下調。有趣的是，在 NP137 治療后，大多數腫瘤細胞的亞區室以類似的方式減少，我們注意到腫瘤簇?2 的減少幅度最強，也顯示出較高的 EMT 評分（圖 5e-h；注意簇?2）具有高 EMT 評分，在 NP137 處理后未檢測到，但我們不能排除它們未被捕獲的可能性，因為這些簇在 C1D1 時已經具有很少的細胞）。
       腫瘤區室中發生的變化也與基質細胞的變化相關（圖5b、c和6）。值得注意的是，NP137 治療顯然對免疫細胞有影響（圖 6a、b）。更具體地說，在NP137治療后，我們注意到具有細胞毒功能的淋巴細胞（CD8+T細胞和自然殺傷（NK）細胞；圖6c）增加。在用 NP137 治療的 Pten f/f 小鼠中也注意到 CD8+ 細胞的類似增加。有趣的是，在 NP137 治療后，我們在 2 號患者的單細胞分析中注意到了這兩種情況。 01-40 號患者的空間轉錄組數據。 01-034和01-039增加了T細胞和腫瘤細胞之間相互作用的數量和強度（圖6d，e）。特別是，單細胞RNA-seq數據顯示CD8+T細胞和腫瘤細胞之間相互作用的數量和強度增加（圖6d）。檢測到 M2 巨噬細胞減少，同時主要組織相容性 I/II 類抗原呈遞增加。 NP137 治療與更有效的抗原呈遞細胞 (APC) 相關，因為我們觀察到與癌細胞相互作用的 C1D1 中的單核細胞明顯轉變為 C3D1 中的樹突狀細胞（圖 6d、e）。

   
4、NP137 抑制化療耐藥
       由于大量文獻將 EMT 描述為化療耐藥的主要原因，并且我們的數據表明靶向 netrin-1 會抑制 EMT，因此我們評估了是否將 NP137 添加到卡鉑-紫杉醇（卡博紫杉醇）（標準化療藥物）中。子宮內膜癌臨床環境中使用的非護理化療可能會增強 Pten f/f 小鼠子宮內膜腺癌模型中單獨使用卡波紫杉醇的療效。NP137/卡博他賽治療被證明優于單獨的卡博他賽，導致小鼠totally緩解。總而言之，這些臨床前和臨床數據表明，臨床階段的藥物既能誘導腫瘤細胞減滅，又能引發 EMT 特征的全面抑制，從而有可能減輕對傳統療法的耐藥性。

實驗方法
RT–qPCR、Bulk RNA-seq、scRNA-seq、IHC分析、多重免疫組化、空間轉錄組學。
參考文獻
Cassier, P.A., Navaridas, R., Bellina, M. et al. Netrin-1 blockade inhibits tumour growth and EMT features in endometrial cancer. Nature 620, 409–416 (2023).