帕金森病（PD）是常見的僅次于阿爾茨海默病的神經退行性疾病，65歲以上人群中有2-3%的人患病。目前還沒有有效減緩疾病進程的治療方法，迫切需要更好地了解疾病機制以支持新療法的開發。PD的特征是黑質致密部多巴胺能神經元的神經變性，導致紋狀體多巴胺耗竭，引起靜止性震顫、運動遲緩和強直等癥狀。另一個神經病理學標志是在剩余神經元和神經元突起中分別存在路易小體（LB）和路易神經突包涵體，主要由錯誤折疊的α-突觸核蛋白（α-syn）聚集物組成。2003年Braak及其同事基于腦內LB病理的特定進展模式提出了臨床前和臨床PD病理分期系統。Braak LB分期范圍從1到6，反映出大腦中LB的分布越來越廣泛，呈現出從頭端到尾端的模式。Braak分期系統被認為反映了疾病進展，隨著疾病過程進一步影響腦區，關鍵臨床癥狀相繼出現。大多數PD是散發性的，可能是由遺傳、表觀遺傳和環境之間的復雜相互作用引起的。全基因組關聯研究發現了90個與PD風險增加相關的基因位點。表觀遺傳學和轉錄組學研究主要在血液和死后腦組織中進行，后者可以說是該疾病核心病理學最具代表性。然而，以往的PD腦轉錄組學研究在樣本數量和所選腦區方面都受到限制。沒有研究使用神經病理學，特別是Braak LB分期作為疾病進展的標志物。該研究發表在《Acta Neuropathologica》，IF：12.7。
技術路線

主要研究結果
1. 不同病理疾病階段個體額上回的基因表達
       在該研究中，作者檢測了84個個體（包括23個非神經系統對照和61個在不同Braak LB分期受α-syn相關病理學影響的個體）的上額葉皮質轉錄組水平的差異。后者根據Braak LB分期分為三個神經病理組：一組由分析組織中沒有LB病理的個體組成，對應Braak LB 1-4期,（n=19），一組由額葉皮層中度LB病理學的個體組成（Braak LB 5期，n=19），另一組由額葉皮層LB負荷較高的個體組成（Braak LB 6期，n=23）。值得注意的是，作者從額葉上皮層提取了RNA，LB在Braak LB 5期出現（圖1）。

圖1 研究概述

       所選個體在人口統計學因素（性別和死亡年齡）和阿爾茨海默?。ˋD）相關病理水平相匹配（圖2）。觀察到接受深部腦刺激手術的個體比例在兩組間有顯著差異（Braak LB 0=0/23，Braak LB 1-4=0/19，Braak LB 5=1/19，Braak LB 6=6/23，p=0.0036，卡方檢驗）。這種差異可以用以下事實來解釋：深部腦刺激可能是較晚期特定患者的一種治療方案。組間癡呆持續時間也有差異，第5組和第6組的癡呆持續時間較長（p=0.0002，Kruskal-Wallis秩和檢驗）。這種差異可歸因于癡呆出現在疾病的晚期階段。值得注意的是，在Braak神經原纖維纏結期、反映總AD相關病理學的復合“ABC評分”、CERAD分期或CAA類型方面，兩組間未發現差異，這表明伴隨的AD病理不是作者分析中的重要混雜因素。此外，所有樣本的死后延遲非常短（平均=377分鐘，標準差=135分鐘），確保了高質量的樣本。
       作者在去除核糖體RNA后進行了RNA測序，在所有樣本中共檢測到21,615個表達的基因，包括長鏈非編碼RNA（lncRNA）。

圖2 個體的人口統計學、樣本信息和病理測量

2. 細胞組成和RNA質量
       在作者的研究中，使用Scaden估計了細胞類型的比例。作者檢驗了細胞類型比例與數據中生物學變異的潛在來源（神經病理分組、性別、死亡時年齡、PMD和RIN）之間的Pearson相關性。神經元的比例與其他細胞類型的比例呈顯著的抗相關（p<0.05）（圖3a）。此外，如既往研究所示，細胞類型比例與RIN值呈正相關（與神經元比例呈正相關，與其他細胞類型比例呈負相關）（圖3a）。細胞類型比例和其他變量（神經病理組、性別、年齡和PMD）之間沒有發現關聯（圖3a）。然后，作者對已知的實驗協變量（性別、死亡年齡、PMD、RIN）進行校正，尋找神經病理學組之間細胞類型比例的差異。在4個神經病理組（0、1-4、5和6）中，任何細胞類型均無顯著差異（p<0.2）（圖3b）。為了證實這一結果，作者也使用標記基因譜估計了樣本中的細胞組成，發現神經病理組（0、1-4、5和6）之間任何細胞類型都沒有顯著差異（p<0.3）。
       由于RNA質量與細胞類型比例相關，而且它也被證明影響基因表達水平測定，因此作者使用質量替代變量分析（qSVA）框架來估計RNA質量混雜因素。采用該方法獲得的5個質量替代變量（qSVs）與已知的與RNA質量相關的變量（RIN和PMD）進行Pearson相關性分析。此外，由于作者已經表明細胞比例與由RIN值測量的RNA質量顯著相關，作者還檢驗了5個qSV和細胞類型比例之間的Pearson相關性。qSV1與所分析的所有變量顯著相關。除PMD與qSV2和qSV3顯著相關外，qSV5與其他變量均顯著相關。最后，qSV4與RIN值顯著相關（圖3c）。因此，作者納入了5個質量替代變量作為協變量，而不是使用樣本的RIN值和PMD。

圖3 細胞組成和RNA質量

3. 不同神經病理分期的差異基因表達
       為了確定表達水平隨LB神經病理學進展而變化的基因組，作者對所有4個神經病理學組的共21,615個轉錄本進行了差異基因表達分析。性別、死亡年齡和5個qSV被用作LRT檢驗的實驗協變量。原假設是基因表達在組間是穩定的，并且檢驗與組順序無關，這可能會檢測出任何可能的上調和下調組合的不穩定表達模式。差異基因表達分析發現四個神經病理組共有266個差異表達基因（LRT檢驗，Benjamini-Hochberg FDR<0.05），其中34個對應于lncRNA。
       為了進一步研究這266個差異表達基因，使用DEGreport R包中的分裂層次聚類對其正則化log2轉換計數進行聚類。差異表達基因被分為8個簇。每個簇的典型神經病理組的表達模式，以及每個基因的縮放表達水平見圖4。

圖4 不同Braak LB分期的差異表達基因簇

       簇1（30個基因）和4（25個基因）的表達分別從Braak LB 0期到6期呈線性上升和下降模式。上調基因簇（1）的命中率最高的基因是SNX7，而下調基因簇（4）的命中率最高的基因是NUCB1。所有其他的基因簇表現出一種表達模式，在Braak LB 1-4期和6期的樣本有相對相似的表達水平，而在Braak LB 5期的樣本與其他組相比顯示出基因表達水平的重大變化。在這些顯示主要轉錄組變化的簇中，簇2和3包含了大部分基因（分別為57和109個）。簇2中最重要的基因是PDXK，而簇3中最重要的三個基因是新的轉錄本。
4. Braak LB 0期對照和Braak LB病理組之間的兩兩差異基因表達
       為了進一步研究Braak LB 5期樣本的主要基因表達變化，作者比較了該組的轉錄組和對照組（Braak LB 0期）的轉錄組。使用Wald檢驗對共21,615個基因進行了差異基因表達分析，使用性別、死亡年齡和5個qSV作為協變量。作者發現在Braak LB 0期和Braak LB 5期樣本之間共有979個差異表達基因（Benjamini-Hochberg FDR<0.05），其中575個表達上調，404個表達下調。在Braak LB 5期差異表達的979個基因中，233個基因在主要分析中比較了所有Braak LB分期組的基因表達差異的266個基因中。值得注意的是，在比較0期和1-4期時，沒有發現在FDR<0.05的差異表達基因，而在Braak LB 0期和6期之間有38個基因有顯著差異表達。在這38個在Braak LB 0期和6期之間有差異表達的基因中，有28個也在Braak LB 0期和5期之間的差異表達基因中。在Braak LB 5期和6期均以SNX7基因為主。這些發現進一步強調了在Braak LB 5期可以觀察到最顯著的額葉皮質基因表達變化。
5. 功能富集分析
       作者對每個神經病理組（1-4、5和6）與對照組的差異基因表達結果進行了功能富集分析。作者納入了所有21,615個基因，并根據每次比較的p值和對數倍數變化對每個基因進行評分。通過這種方法，作者發現從Braak LB 0期到1-4期顯著富集了99條GO通路（FDR<0.05），從Braak LB 0到5期顯著富集了75條通路，從Braak LB 0到6期顯著富集了163條通路。作者生成了火山圖，突出了在每個Braak LB分期富集的三個最重要的通路所涉及的基因。所有通路的調控方向是由每個通路所涉及的大多數基因驅動的。這排除了通路發現是由單基因表達變化驅動的可能性。在總結GO通路時，作者發現在Braak LB 1-4期富集的通路有29條，在Braak LB 5期富集的通路有31條（圖5），在Braak LB 6期富集的通路有39條。此外，作者發現在所有Braak LB分期富集的通路有12條（均為下調），這些通路主要涉及ATP代謝過程。

圖5在Braak LB 5期富集的通路

6. 風險基因
       為了研究部分SNPs與PD相關的功能和分子機制，作者提取了與90個帕金森病風險SNPs最近的基因和QTL指定基因。選取的98個基因中有87個在樣本中表達。在Braak LB 0期和Braak LB 5期的差異表達基因中有5個（Benjamini-Hochberg FDR<0.05）。在Braak LB 5期的差異表達基因中，PD基因的富集沒有統計學意義（X²（1，n=21,615）=0.084，p=0.773）。為了進一步研究這些基因，作者進行了eQTL分析，以評估這5個基因的表達是否與附近PD風險SNP的基因型相關。作者發現rs11683001與其最近的基因MAP4K4之間存在關聯（校正后p=0.025）（圖6a）。值得注意的是，在樣本中表達的87個風險基因都不在Braak LB 0期和Braak LB 6期之間差異表達的基因中。
       作者最近報道了與TMCC2、SFMBT2、AKAP6和PHYHIP附近的與Braak LB分期相關的差異甲基化復制位點。作者發現所有4個基因都在樣本中表達。其中一個位于cg04011470附近的基因PHYHIP也是Braak LB 5期的差異表達基因之一（圖6b）。

圖6 風險基因

結論
       綜上所述，作者對Braak LB各階段的轉錄組學分析表明，只有當LB首次出現在研究的病變組織中時，才能觀察到基因表達的主要變化，而在LB出現之前和之后，只有微小的變化可以檢測到。此外，作者證實了參與ATP代謝過程和突觸損傷的通路在疾病的各個階段都有富集。相反，與免疫反應相關的通路在LB形成之前被上調，然后在疾病的后期被下調，突顯了免疫反應是未來疾病修飾治療的可能靶點之一。作者還發現了可能參與PD發病的單個基因（SNX7，NUCB1，PDXK，PHYHIP和MAP4K4），并指出了lncRNA在疾病發病機制中的潛在作用。

實驗方法
RNA測序
參考文獻
Cappelletti C, Henriksen SP, Geut H, Rozemuller AJM, van de Berg WDJ, Pihlstr?m L, Toft M. Transcriptomic profiling of Parkinson's disease brains reveals disease stage specific gene expression changes. Acta Neuropathol. 2023 Jun 22. doi: 10.1007/s00401-023-02597-7.