糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是導(dǎo)致終末期級腎臟疾病的主要原因，而組織病理學(xué)腎小球病變是DN最早的結(jié)構(gòu)改變之一。然而，啟動這些腎小球改變的信號通路尚不完全清楚。為闡明DN發(fā)生的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)，作者對DN早期的2型糖尿病小鼠腎臟細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞和整體RNA測序。差異表達(dá)基因分析顯示，腎小球細(xì)胞類型中葡萄糖?獨立應(yīng)答。腎小球細(xì)胞程序上游的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提示機械敏感性轉(zhuǎn)錄通路MRTF?SRF的激活主要發(fā)生在系膜細(xì)胞。重要的是，在獨立的患者隊列數(shù)據(jù)中，在DN腎小球中也發(fā)現(xiàn)MRTF?SRF轉(zhuǎn)錄通路的激活。此外，體外腎灌注提示MRTF - SRF的調(diào)節(jié)是腎小球過濾的常見機制。總的來說，本研究展示早期DN的單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，突出機械敏感信號通路作為糖尿病腎病的新靶點。本研究于2023年1月10日發(fā)表于期刊《Genome Med》，IF：10.18。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、早期DN的BTBR ob/ob小鼠腎臟的scRNA-seq

作者生成了BTBR.Cg-Lep^{ob/ob WiscJ}；Gt (ROSA)26Sor^{tm4(ACTB?tdTomato,?EGFP)Luo}；Tg(NPHS2-cre)^295Lbh；小鼠足狀突細(xì)胞報告（簡稱BTBR ob/ob或DN小鼠），以研究DN中發(fā)生的細(xì)胞和分子變化。基于研究前期的預(yù)實驗觀察，本研究將6周齡定義為DN發(fā)病期，12周齡定義為DN早期。

從總共16只小鼠中取樣腎組織，包括6周齡和12周齡的BTBR ob/ob（DN）和BTBR WT（對照）小鼠中的雄性和雌性小鼠。使用Percoll梯度部分去除樣品的近端小管（PT）段，以富集腎小球。使用冷活化蛋白酶（CAP）制備單細(xì)胞懸液，以減少腎細(xì)胞中解離誘導(dǎo)的假象。共70944個細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理和質(zhì)量控制（圖1B）。每種細(xì)胞類型的定義標(biāo)記基因和每個簇的五篇標(biāo)記基因在點圖（圖1C）。

2、DN腎臟細(xì)胞類型特異性改變提示糖尿病的葡萄糖依賴性和葡萄糖非依賴性反應(yīng)

接下來，作者比較DN與對照腎臟中細(xì)胞類型中基因表達(dá)水平。總體上，作者發(fā)現(xiàn)6周時，所有類型的細(xì)胞中有447個差異表達(dá)基因（DEGs）；12周時，所有類型的細(xì)胞中有740個DEGs（圖1D）。表明主要是這兩種類型細(xì)胞在DN的早期階段受到影響。富集分析在6周和12周時在腎小球細(xì)胞類型和PT細(xì)胞類型中識別出顯著的通路（圖1E-F）。腎小球細(xì)胞類型表現(xiàn)出對細(xì)胞外基質(zhì)分子、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖等的調(diào)節(jié)作用，以及對機械應(yīng)力、細(xì)胞因子和血壓的細(xì)胞應(yīng)答。PT細(xì)胞類型表現(xiàn)出多種代謝過程，例如生物氧化，以及參與氧化應(yīng)激的反應(yīng)，例如NRF2和PPAR信號通路。這些差異表明早期DN中PT和腎小球細(xì)胞類型分別具有葡萄糖依賴性和葡萄糖非依賴性反應(yīng)。

圖1 早期DN的BTBR ob/ob小鼠腎臟的scRNA-seq

3、人類和實驗性DN的共同特征

將來自scRNA-seq的細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)與大量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。足細(xì)胞、EC_1/gECs和系膜細(xì)胞顯示正Pearson相關(guān)系數(shù)，表明兩個數(shù)據(jù)集之間存在線性相關(guān)性（圖2A）。將單細(xì)胞和大量RNA-seq數(shù)據(jù)集的腎小球DEGs取交集，得到194個獨特基因（圖2B），這些基因被映射到歐洲腎臟cDNA庫（ERCB）患者數(shù)據(jù)集。在顯微解剖的DN患者腎小球中，106個基因的mRNA表達(dá)受到顯著調(diào)節(jié)（圖2B-C）。重要的是，在單細(xì)胞和大量RNA-seq數(shù)據(jù)中，在人DN腎小球中檢測到的大多數(shù)DEGs在系膜細(xì)胞中均發(fā)生顯著變化（圖2C）。

圖2人類和實驗性DN的共同特征

4、DN腎小球中機械敏性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被激活

為識別DN腎小球細(xì)胞類型中導(dǎo)致基因差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者使用獨創(chuàng)性途徑分析（IPA）進(jìn)行上游分析，該分析不僅識別轉(zhuǎn)錄因子，還識別轉(zhuǎn)錄輔調(diào)控因子，如輔激活因子。在單細(xì)胞和體RNA-seq數(shù)據(jù)中通常改變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如圖3A所示。有趣的是，作者觀察到機械敏感轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的激活，包括心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A和B（MRTFA/B）和yes相關(guān)蛋白1（YAP1或YAP），以及轉(zhuǎn)錄因子血清反應(yīng)因子（SRF）。SRF活性在系膜細(xì)胞中較高，在足細(xì)胞和gECs中等或較低（圖3B）。

在DN腎小球細(xì)胞類型中具有顯著調(diào)控作用的MRTF-SRF轉(zhuǎn)錄靶基因如圖3C所示。MRTFA和在足細(xì)胞和gEC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)MRTFB，在對照組和DN小鼠中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平（圖3D）。對照組小鼠系膜細(xì)胞中MRTFA表達(dá)水平較低，而DN小鼠中部分系膜細(xì)胞中MRTFA核積累（圖3D）。重要的是，MRTFB在系膜細(xì)胞中的核積累是明顯的，特別是在系膜擴(kuò)張發(fā)生的區(qū)域（圖3D）。

圖3 DN腎小球中機械敏性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被激活

5、MRTF轉(zhuǎn)錄靶基因在DN合并2型糖尿病患者中表達(dá)上調(diào)

微解剖腎小球mRNA表達(dá)分析顯示，小鼠DN中顯著改變的各種基因在早期人類DN中也被顯著調(diào)控（圖4A）。其中許多靶基因與系膜體積呈正相關(guān)（圖4B）。MRTF轉(zhuǎn)錄靶基因被定位于ERCB數(shù)據(jù)集。這些基因在腎病和其他可能引起機械應(yīng)激的疾病以及腎小球硬化的各種其他腎小球疾病的腎小球中被顯著調(diào)控，但在微小變化疾病（MCD）中沒有（圖4C）。

接下來，作者通過免疫熒光染色研究早期人DN的MRTFA和MRTFB的表達(dá)和位置。在健康和早期DN腎活檢樣本中，所有三種腎小球細(xì)胞類型中檢測到MRTFA的基礎(chǔ)和相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平（圖5）。與小鼠實驗結(jié)果一致，DN、MRTFB在健康人大部分系膜細(xì)胞中不存在，但在腎小球病變處的系膜細(xì)胞核中積累（圖5）。總之，作者對人和小鼠DN的免疫熒光染色分析證實MRTFB在DN早期系膜細(xì)胞中的激活。

圖4 MRTF轉(zhuǎn)錄靶基因在DN合并2型糖尿病患者中表達(dá)上調(diào)

圖5 免疫熒光驗證早期DN系膜細(xì)胞中MRTFB的激活

6、腎小球系膜細(xì)胞表現(xiàn)出主要的信號網(wǎng)絡(luò)

作者的結(jié)果表明，MRTF-SRF轉(zhuǎn)錄調(diào)控在小鼠和人DN中都被激活，主要是在系膜細(xì)胞中。此外，作者還鑒定多種系膜細(xì)胞標(biāo)記基因，這些基因編碼跨膜蛋白，負(fù)責(zé)機械信號的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括機械敏感離子通道（MSCs）、GPCRs、整合素和鈣粘蛋白（圖6A）。接著，作者比較DN與對照組小鼠中所有腎細(xì)胞類型之間的相互作用強度，結(jié)果顯示DN腎臟中系膜細(xì)胞與所有其他細(xì)胞類型的相互作用主要（圖6B）。此外，系膜細(xì)胞主導(dǎo)細(xì)胞間通信（圖6C），并在DN腎小球中作為發(fā)送者與gEC和足細(xì)胞廣泛相互作用（圖6D）。這些相互作用涉及各種眾所周知的與慢性腎臟疾病（CKD）發(fā)病機制相關(guān)的生長因子信號通路，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），成纖維細(xì)胞生長因子（FGF），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），以及多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和整合素之間的相互作用。

圖6 腎小球系膜細(xì)胞表現(xiàn)出主要的信號網(wǎng)絡(luò)

7、體外腎灌注激活機械敏感信號通路

作者分別生成了離體小鼠腎小球（圖7A）和豬腎皮質(zhì)組織的整體和單核轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。并比較灌注和未灌注情況下的基因表達(dá)。在體外灌注的小鼠腎小球中，上游的DEGs分析顯示MRTFA/B、SRF和YAP1被激活（圖7B）。對顯著改變的MRTF轉(zhuǎn)錄靶基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)了肌動蛋白細(xì)胞骨架組織、VEGFA-VEGFR2信號通路、平滑肌收縮、PDGFRB通路以及細(xì)胞對外部刺激的反應(yīng)（圖7C）。在體外灌注的豬腎中，從灌注和未灌注的腎皮質(zhì)組織中共鑒定出11692個單核（圖7D）。基于之前報道的單核細(xì)胞數(shù)據(jù)的細(xì)胞/核他異性標(biāo)記基因，Unsupervised clustering識別出18個簇，將其分為12種細(xì)胞類型（圖7E）。作者鑒定主要的腎小球細(xì)胞類型，包括由核標(biāo)記基因MEIS1和FHL2定義的基質(zhì)細(xì)胞類型（圖中“STROMA”表示）（圖7F）。豬腎皮質(zhì)免疫熒光染色顯示，MEIS1陽性細(xì)胞主要由系膜細(xì)胞組成，也有部分間質(zhì)細(xì)胞（圖7G）。對DEGs的上游分析顯示，基質(zhì)細(xì)胞中MRTFA/B、SRF和YAP1被激活，足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中YAP1和MRTFB被激活（圖7H）。顯著調(diào)控的MRTF轉(zhuǎn)錄靶基因主要存在于基質(zhì)細(xì)胞中（圖7I）。這些發(fā)現(xiàn)支持作者的假設(shè)，即機械敏感信號通路的激活是腎小球過滲反應(yīng)的常見機制。

圖7腎體外灌注激活機械敏感信號通路

結(jié)論：

作者的研究展示早期DN的全面單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀，并揭示隨著DN的發(fā)生和發(fā)展而發(fā)生的基因表達(dá)的細(xì)胞特異性改變。作者對腎小球細(xì)胞類型的深入分析表明，機械敏感信號與糖尿病性腎小球病變相關(guān)，并可能在腎小球過滲反應(yīng)中發(fā)揮驅(qū)動作用。在腎小球硬化的背景下，MRTF轉(zhuǎn)錄途徑可能是腎小球共同機制的一部分。

參考文獻(xiàn)：

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