類風濕性關節炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜組織腫瘤樣增生，持續性滑膜炎癥，骨侵蝕和進行性關節破壞。類風濕性關節炎通常發生在中年女性中。目前，RA的發展歸因于遺傳和環境因素，如吸煙，肥胖，壓力，神經抑郁和女性荷爾蒙。RA患者發生惡性腫瘤的風險高于一般人群。最近，RA患者的臨床癥狀和并發癥的管理越來越受到醫務工作者的關注。深入了解RA發生和發展的機制有助于及早發現RA及其并發癥，以便采取措施控制疾病的發展并減少疾病的活動。該研究發表于《Frontiers in Immunology》，IF：8.786。

技術路線：

研究示意圖：

圖1 研究示意圖

主要研究結果：

1. 使用m6A調節器的RA分類方法的性能

考慮到m6A甲基化調節劑在腫瘤和免疫疾病進展中的重要作用，作者使用公共數據集全面探討了19種m6A甲基化調節劑對RA診斷的重要性?；谶@19種m6A甲基化調節因子的表達水平，使用五種不同的機器學習方法構建了疾病診斷模型（RA與非RA）：使用Boruta，Rpart，LASSO，XGBoost和邏輯回歸的隨機森林優化。除Rpart模型外，所有模型的精度和AUC均大于0.8。為了比較每種機器學習方法的性能，作者觀察了每個模型作為驗證集中分類器的性能。驗證集中每種機器學習方法的性能也是可變的（圖2A-F）。在驗證數據集1中，邏輯回歸模型和LASSO_λ-min 模型的 AUC 最高（0.90），但 LASSO_λ-min 模型的準確度更高（0.901）。Rpart模型的AUC最低（0.8）。在驗證數據集2中，LASSO_λ-min 模型和 LASSO_λ-1se 模型的準確度最高（0.89）和 AUC（0.88）。在這些模型中，Rpart模型的性能最差。此外，每種機器學習方法選擇的m6A甲基化調節劑數量不同，Boruta選擇最多（14個調節劑），Rpart模型僅選擇一個調節劑?？紤]到每種機器學習方法在驗證集中的性能及其在模型中選擇的調節器數量，LASSO_λ-1se模型不僅在驗證集中表現更好，而且在變量篩選方面也表現出更嚴格的要求。這些結果表明，LASSO_λ-1se模型具有良好的臨床應用價值和實用性。因此，作者進一步比較了LASSO_λ-1se模型在全血樣品中的性能，并計算出AUC值為0.83（圖2G），進一步提示LASSO_λ-1SE模型在基于血液的RA診斷中具有臨床應用前景。

圖2 驗證集1和驗證集2的ROC曲線，模型在單獨的集上訓練

2. RA分類中更重要的m6A甲基化調節劑

通過這些多變量機器學習方法選擇不同的候選生物標志物。然而，生物標志物通常具有相同的準確性和重要性?？紤]到Rpart模型的性能最差，作者專注于不同機器學習方法選擇的重疊m6A甲基化調節因子，包括使用Boruta，LASSO，XGBoost和邏輯回歸（圖3A）。每種型號都選擇了兩種重疊的m6A甲基化調節劑：IGF2BP3和YTHDC2。在訓練數據集中進一步比較了19 m6A甲基化調節劑的表達水平。IGF2BP3和YTHDC2在RA和非RA患者中的表達水平差異有統計學意義（圖3B）。更重要的是，基于轉錄水平，IGF2BP3和YTHDC2在訓練集中的RA診斷中也表現良好（圖3C），AUC值分別為0.85和0.75。此外，當Boruta（圖3D）、Rpart（圖3E）和XGBoost（圖3F）算法計算了19 m6A甲基化調節劑的重要性，IGF2BP3和YTHDC2排名較高；IGF2BP3 具有最高的重要性。

圖3 在RA分類中比較重要的m6A甲基化調節劑

3. IGF2BP3在RA-FLS的活力和細胞周期中的重要性

根據途徑富集分析結果，IGF2BP3和YTHDC2與細胞周期密切相關。但是，當Boruta（圖3D）、Rpart（圖3E）和XGBoost（圖3F）算法計算了19 m6A甲基化調節因子的重要性，IGF2BP3排名第一，YTHDC2排名較低。此外，與YTHDC2相比，IGF2BP3對RA的診斷效能更好（圖3C）。因此，作者通過分子生物學實驗進一步探討了IGF2BP3對RA-FLSs活力和細胞周期的調控作用。為了探索IGF2BP3對RA-FLS的影響，將siRNA轉染到RA-FLS中。RT-qPCR和蛋白質印跡法證實了轉染結果，表明siRNA具有良好的敲低效率（圖4B-D）。然后，作者研究了IGF2BP3對體外RA-FLS活力的影響。CCK-8細胞毒性測定顯示，與對照細胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下調顯著降低了細胞活力（P<0.05，圖4E）。細胞增殖測定還顯示，與對照細胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下調顯著抑制了細胞增殖（P<0.05，圖4F）。此外，流式細胞術結果顯示，IGF2BP3的低表達對G2/M通道有明顯影響。與對照組相比，siIGF2BP3組G2/M期細胞比例顯著增加（P<0.05，圖4G，H）。作者還測量了細胞周期相關蛋白的表達，表明siIGF2BP3降低了CCNB1和C-MYC的表達（圖4C，D）。此外，檢測OA（osteoarthritis）和RA患者滑膜組織中IGF2BP3的表達。作者發現RA患者滑膜組織中IGF2BP3表達顯著較高，進一步證實了 IGF2BP3 在 RA 進展中的重要性（圖4I）

圖4 IGF2BP3在RA-FLS的活力和細胞周期中的重要性

4. IGF2BP3表達與炎癥活性的相關性

為了鑒定RA中IGF2BP3相關的免疫特征，作者用xCell確定了免疫評分和免疫細胞的比例。首先，作者發現兩組之間的免疫評分差異有統計學意義，RA患者組的免疫評分高于NC患者組（P<0.001；圖5A）。然后，比較兩組免疫細胞的比例。許多免疫細胞的比例存在顯著差異，包括指間細胞（IDC）、自然殺傷T（NKT）細胞、經典樹突狀細胞（cDC）、巨噬細胞、肥大細胞、M2巨噬細胞、Th2細胞、M1巨噬細胞和肌細胞（圖5B，C）。在這些細胞類型中，作者專注于M1巨噬細胞，因為M1巨噬細胞與RA之間存在密切關系。RA患者M1巨噬細胞比例顯著高于對照患者。此外，作者研究了類風濕性關節炎患者M1巨噬細胞比例與IGF2BP3表達水平的關系，發現它們具有很強的相關性（圖5D）。IGF2BP3表達也與M1巨噬細胞標志物的表達顯著相關，包括IL1A、CD86和TLR2（圖5E-G）。因此，作者認為IGF2BP3可以參與M1巨噬細胞極化的調節。

為了進一步探索IGF2BP3對M1巨噬細胞極化的影響，作者用Igf2bp3-siRNA或NC-siRNA（陰性對照）轉染了RAW264.7細胞。通過RT?qPCR和蛋白質印跡分析確認了基因沉默的效率，表明siRNA具有良好的敲低效率（圖5H，I）。轉染后48小時，用100ng/ml LPS處理RAW264.7細胞24小時。然后，通過流式細胞術測定M1巨噬細胞表面標志物（CD86）的表達，作者發現CD86在siIgf2bp3細胞中的表達水平明顯低于siNC細胞（圖5J）。此外，作者進一步檢測了細胞上清液中TNF-a的含量，這表明siIgf2bp3細胞中TNF-a的含量低于siNC細胞（圖5K）。這些結果進一步驗證了IGF2BP3參與M1巨噬細胞極化的調節。

圖5 IGF2BP3表達與炎癥活性之間的相關性

5. scRNA-seq揭示了IGF2BP3表達與M1巨噬細胞極化的關系

為了進一步確定IGF2BP3表達和M1型巨噬細胞極化之間的關系，我們在GSE159117數據集中進行了scRNA-seq。通過統一流形近似和投影（UMAP）分析得到14個細胞簇（圖6A）。SingleR（版本1.8.1）用于鑒定7種細胞類型：B細胞，CD4 T細胞，CD8 T細胞，樹突狀細胞，單核細胞，NK細胞和T細胞（圖6B）。發現IGF2BP3主要在七種細胞類型（圖6C）。巨噬細胞是來源于單核細胞的主要細胞類型。因此，探討CD86與IGF2BP3在單核細胞中的表達關系，發現CD86和IGF2BP3具有共表達趨勢（圖6D）。然后，作者初步研究了幾種巨噬細胞標志物在單核細胞中的表達。M1巨噬細胞標志物（包括CD86，IL1B，TLR2和TLR4）在單核細胞中顯著上調，但M2巨噬細胞標志物（包括MSR1，IL10，MMP14和VEGFA）下調（圖6E）。

圖6 UMAP圖顯示了收集的scRNA-seq細胞樣品的來源

結論：

該研究首次證實了m6A閱讀器蛋白IGF2BP3對RA進展的影響，并通過生物信息學分析和分子生物學實驗驗證了其生物學功能。該研究為RA的早期診斷和靶向治療提供了新的思路和策略，具有理論創新前景。此外，它還為發現RA的新標志物和藥物靶點提供了理論支持。

參考文獻：

Geng Q, Cao X, Fan D, Gu X, Zhang Q, Zhang M, Wang Z, Deng T, Xiao C. Diagnostic gene signatures and aberrant pathway activation based on m6A methylation regulators in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 2022 Dec 13;13:1041284. doi: 10.3389/fimmu.2022.1041284. PMID: 36582238; PMCID: PMC9793088.