奧沙利鉑是結直腸癌（CRC）手術后常用的化療方案。然而，獲得性耐藥嚴重影響CRC患者的療效，其機制尚不清楚。本文鑒定circRNA circATG4B在結直腸癌奧沙利鉑耐藥中起重要作用。并發現circATG4B通過促進自噬誘導奧沙利鉑耐藥。此外，circATG4B的作用歸因于其編碼一種新型蛋白質circATG4B-222aa的潛力。進一步研究發現circATG4B-222aa作為誘餌，和TMED10競爭與ATG4B的相互作用，導致自噬增加，隨后誘導耐藥。因此，本研究揭示外泌體circATG4B參與CRC細胞化療敏感性的降低，為CRC奧沙利鉑耐藥的潛在治療靶點提供新的理論依據。本研究于2022年12月9日發表于《AdvSci (Weinh)》，IF：17.521

技術路線：

主要研究結果：

1、ATG4B相關circRNA在奧沙利鉑耐藥中的分析

越來越多的證據證明circRNA參與宿主基因的功能。基于在線數據庫circBase，作者評估15種源于ATG4B的circRNA的表達，發現hsa_circ_0 007159 （circATG4B）在奧沙利鉑耐藥患者CRC組織中顯著上調（圖1A），與細胞表達狀態一致（圖1B）。以cDNA和基因組DNA（gDNA）為模板，對PCR產物進行電泳驗證，結果表明，擴增的cDNA中只有預期大小的產物，而gDNA中沒有（圖1C）。此外，Sanger測序證實擴增的circATG4B頭尾剪接，提示circATG4B來源于ATG4B基因的外顯子，這與circBase中circATG4B數據是一致的（圖1D）。與線性形式相比，circATG4B具有較長的半衰期，并對RnaseR處理具有抗性（圖1E-F），進一步說明circATG4B確實以環狀形式存在。FISH結果顯示circATG4B主要定位在細胞質中，在耐奧沙利鉑CRC細胞中比敏感細胞中含量高的多（圖1G）。接著，作者評估幾種奧沙利鉑耐藥細胞系和匹配的CRC細胞中的circATG4B水平。與這些結果一致的是，circATG4B在奧沙利鉑耐藥細胞系顯著高表達（圖1H）。Kaplan - Meier生存分析顯示，在circATG4B低表達的患者中，接受奧沙利鉑治療的患者無病生存期（DFS）顯著長于對照組（圖1I）。相反，在circATG4B水平較高的患者中，奧沙利鉑治療組與對照組的DFS時間無差異（圖1J）。此外，作者發現奧沙利鉑治療僅在circATG4B低表達的患者中是獨立的預后因素，而在circATG4B高表達的患者中則不是（表1）。此外，在接受奧沙利鉑治療的隊列中，與circATG4B低表達的患者相比，circATG4B高表達的患者有更差的DFS（圖1K）。這些結果表明circATG4B與CRC細胞對奧沙利鉑的反應密切相關。

圖1 circATG4B在奧沙利鉑相關CRC細胞過表達

表1

2、外泌體轉移的circATG4B誘導奧沙利鉑耐藥

作者猜想circATG4B可能從奧沙利鉑耐藥CRC細胞通過外泌體轉移到奧沙利鉑敏感細胞。為證明這個猜想，作者從耐奧沙利鉑CRC細胞上清中分離出外泌體，經電鏡鑒定為典型的具有雙層膜的圓形顆粒（圖2A）。NTA（納米顆粒追蹤分析）發現顆粒大小（圖2B）。圖2C展示外泌體外泌體因子CD45，CD9和Annexin的表達。qRT-PCR顯示，circATG4B在奧沙利鉑耐藥CRC細胞系中明顯上調，尤其是在HCT116-L-OHP和SW480-L-OHP細胞系衍生的外泌體中上調（圖2D），與細胞表達水平一致。當CRC細胞與來自奧沙利鉑耐藥CRC細胞的外泌體（PKH26標記）共培養時，在受體細胞中觀察到大量外泌體（紅色），表明CRC細胞具有較高的外泌體攝取效率（圖2E）。在與分離的外泌體或PBS在母本細胞中孵育后，作者發現circATG4B由于與用si-NC或不使用si-NC處理的奧沙利鉑耐藥細胞的外泌體共培養而顯著上調，當外泌體的circATG4B被siRNA擊殺后，這一現象被逆轉（圖2F）。

假定外泌體circATG4B來源于奧沙利鉑耐藥細胞，作者進一步研究其對化療耐藥的影響。作者的結果展示與exo-si-NC相比，共孵育exo-si-circATG4B增加CRC細胞中奧沙利鉑對小鼠細胞凋亡的抑制率和誘導率（圖2G-H）。為探索體內外泌體circATG4B的作用，采用皮下注射HCT116細胞建立小鼠異種移植模型。每4天測量一次腫瘤的大小，16天后處死所有的小鼠（圖2I）。exo-si- NC處理的腫瘤的生長率和腫瘤重量均高于外源性exo-si-circATG4B或PBS處理的腫瘤（圖2J-L）。這表明CRC中外泌體circATG4B對奧沙利鉑的敏感性降低。以上結果說明外泌體轉移的circATG4B誘導奧沙利鉑耐藥。

圖2外泌體轉移的circATG4B誘導奧沙利鉑耐藥

3、外泌體CircATG4B提高奧沙利鉑抗藥過程的活性

自噬在化療耐藥中起著重要的作用，因此作者測量抗奧沙利鉑細胞和親代細胞的自噬水平。值得注意的是，在奧沙利鉑耐藥細胞中觀察到LC3B-II/I的比例高于相應的親本細胞（圖3）。為確定自噬是否對奧沙利鉑耐藥至關重要，作者用雷帕霉素（RAPA，自噬誘導物）處理CRC細胞，發現RAPA治療誘發藥物耐藥（圖3B）。相反，作者發現3-MA（甲基腺嘌呤），一種常見的自噬抑制劑，增加耐藥CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性（圖3C），進一步表明自噬在奧沙利鉑耐藥中起重要作用。此外，作者發現用外對照處理的CRC細胞比用PBS處理的細胞表現出更高的耐藥性，并且這種化學耐藥性在用PBS處理后大大逆轉（圖3D），表明外泌體可能通過調節自噬，促進從藥物敏感到耐藥的轉變。轉染circATG4B過表達質粒的CRC細胞化療耐藥性增加。然而，3-MA處理逆轉這種效應(圖3E )，表明circATG4B可以通過自噬誘導化療耐藥。此外，作者探究外泌體circATG4B在自噬過程中的作用。用奧沙利鉑耐藥的CRC細胞分泌的多種外泌體處理后，在受體細胞系HCT116和SW480中進行一系列實驗。免疫熒光（IF）染色結果顯示，exo-si-NC預處理的CRC細胞中自噬小體形成顯著增加，而circATG4B水平降低的外泌體預處理的CRC細胞中綠色斑點數量減少（圖3F）。此外，TEM分析顯示，exo-si-NC預處理后自噬體數量增加，而exo-sio-circATG4B預處理后自噬體數量明顯減少（圖3G）。此外，與PBS處理相比，轉染si - NC的奧沙利鉑耐藥結直腸癌細胞分泌的外泌體處理顯著促進LC3B - I到II的轉化，而當外泌體circATG4B被敲低時，LC3B - II積累被抑制（圖3H）。此外，在前期建立的異種移植小鼠模型中IHC結果顯示，與exo-si-NC組相比，exo-si-circATG4B處理的CRC細胞中p62的表達水平顯著升高，LC3B和Ki67（細胞增殖的標志物）的表達水平降低（圖3I），進一步證實外泌體circATG4B通過調節自噬誘導奧沙利鉑耐藥。

圖3外泌體circATG4B促進自噬水平

4、CircATG4B編碼一種新的222氨基酸（aa）蛋白，CircATG4B-222a

RIP結果顯示circATG4B與AGO2不相關（圖4A），提示circATG4B可能通過不同的機制行使其功能。查閱circ RNA Db中的注釋，作者發現circATG4B有一個669 nt的開放閱讀框（ORF），具有編碼222個氨基酸蛋白的潛力（圖4B）。在circATG4B的ORF中，circRNA序列中串聯的' AUG '密碼子可以啟動新蛋白的翻譯，而終止密碼子' UAG '可以終止翻譯。包含有33個特異性氨基酸的新序列命名為' circATG4B-222aa '（圖4C）。

由于circRNA沒有5′- cap序列，可以啟動蛋白質翻譯，因此需要一個內部核糖體進入位點（IRES）。作者在ORF中發現一個IRES，并通過雙熒光素酶實驗驗證circATG4B中IRES的活性（圖4D-E）。為確認circATG4B - 222aa的存在，研究構建4個帶有不同flag標簽的載體，并將其克隆到CMV誘導表達載體中（圖4F）。在轉染circATG4B - flag載體或circATG4B - flag - mut載體的CRC細胞中，circATG4B的表達明顯上調。與轉染空載體相比，轉染circATG4B - 222aa載體并未明顯改變circATG4B的表達（圖4G）。這4種載體均不影響線性ATG4B mRNA水平。此外，ATG4B的表達不受4種載體的影響（圖4H）。最后，通過SDS - PAGE分離轉染circATG4B和空載體的HEK - 293T細胞總蛋白，切取大小約為24 kD的蛋白條帶進行LC - MS / MS分析，成功鑒定出circATG4B剪接連接處形成的獨特肽段序列，表明circATG4B能夠編碼一種新的蛋白（圖4I）。此外，circATG4B - 222aa在化療耐藥的CRC細胞系中表達明顯升高（圖4J）。將帶有鞭毛的circATG4B - 222aa轉染至HCT116細胞后，使用抗鞭毛抗體進行免疫熒光染色以鑒定circATG4B-222aa的細胞質定位（圖4K）。最后，circATG4B - 222aa表達與接受奧沙利鉑治療的CRC患者的不良預后呈正相關，表明circATG4B - 222aa可能是奧沙利鉑耐藥的預后標志物（圖4L）。

圖4 circATG4B編碼能力的評價

5、CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加體內CRC細胞自噬并誘導奧沙利鉑耐藥

為探究circATG4B - 222aa的生物學功能，將上述4種帶不同flag標簽的載體轉染CRC細胞系。轉染circATG4B或circATG4B - 222aa過表達載體后，LC3B的點狀聚集數量、自噬體形成和LC3B - I / II的轉換均顯著增加（圖5A-C）。而轉染circATG4B - mut載體的CRC細胞無明顯變化，推測其無法啟動circATG4B - 222aa的翻譯。這些結果表明，僅過表達circATG4B - 222aa可增加自噬水平。有趣的是，過表達circATG4B - 222aa降低奧沙利鉑敏感性和奧沙利鉑誘導的細胞凋亡。而過表達突變體circATG4B對這些現象無明顯影響（圖5D-E）。為進一步探討circATG4B - 222aa在體內的作用，通過皮下注射穩定轉染不同circATG4B載體的HCT116細胞建立異種移植小鼠模型。每4 d測量一次腫瘤的大小，circATG4B和circATG4B - 222aa組的生長速度和腫瘤重量均大于vector對照組和circATG4B - mut組（圖5F-H）。檢測裸鼠移植瘤中LC3B、p62和Ki67的表達。IHC結果顯示，與對照組和circATG4B - mut組相比，circATG4B和circATG4B - 222aa組中LC3B和Ki67的表達水平顯著升高，p62的表達水平顯著降低（圖5I）。總之，這些結果表明circATG4B-222aa而不是circATG4B增加CRC細胞的自噬并誘導奧沙利鉑耐藥。

圖5 CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加體內CRC細胞自噬并誘導奧沙利鉑耐藥

6、CircATG4B-222aa防止ATG4B的影響TMED10介導的抑制

為探索circATG4B - 222aa在自噬中的潛在作用機制，將帶有鞭毛的circATG4B - 222aa質粒轉染至HEK - 293T細胞中，免疫共沉淀和質譜分析檢測circATG4B - 222aa潛在的相互作用蛋白。作者對差異表達蛋白進行鑒定（圖6A），發現在識別蛋白的排序列表中豐度最高的蛋白為TMED10（圖6B）。因此，推測TMED10是circATG4B - 222aa的潛在靶點。此外，進一步的實驗證實circATG4B - 222aa在CRC細胞中確實與TMED10存在相互作用（圖6C）。在HCT116細胞中轉染帶有flag標簽的circATG4B - 222aa，免疫熒光染色也表明circATG4B - 222aa與TMED10存在共定位（圖6D）。

為探究TMED10與circATG4B - 222aa相互作用的結構域，作者構建一系列帶有GFP標簽的TMED10缺失突變體（圖6E）。TMED10的LD - only突變體與circATG4B - 222aa不結合，表明TMED10的TD和CD都是TMED10與circATG4B - 222aa相互作用所必需的（圖6F）。通過對circATG4B - 222aa的帶有flag標簽的截短突變體進行Co - IP分析，作者也鑒定circATG4B - 222aa參與TMED10 - circATG4B - 222aa相互作用的區域（圖6G）。circATG4B-222aa ( aa1 - 111)和circATG4B - 222aa ( aa112 ~ 222)的截短體均可被TMED10拉下（圖6H），表明全長circATG4B - 222aa與TMED10存在相互作用。

在進一步的研究中，作者發現circATG4B - 222aa的表達增加LC3B - I / II的轉換，但兩個截短突變體均不能（圖6I），表明全長circATG4B - 222aa負責自噬過程。Co - IP結果表明，過表達circATG4B - 222aa削弱TMED10與ATG4B的相互作用（圖6J），表明circATG4B - 222aa導致ATG4B與TMED10解離。作者進一步在CRC細胞中驗證TMED10與circATG4B - 222aa的相互作用。在CRC細胞中，增加circATG4B - 222aa水平通過激活ATG4B增強GLUC連接的LC3的切割（圖6K）。這些結果表明circATG4B - 222aa可能作為TMED10的誘餌，逃避TMED10誘導的ATG4B抑制。

圖6 CircATG4B-222aa防止ATG4B的影響TMED 10介導的抑制

7、在奧沙利鉑耐藥的CRC細胞中，CircATG4B – 222aa逆轉TMED10誘導的化療敏感性

隨后，作者評估circATG4B - 222aa與TMED10的相互作用在奧沙利鉑耐藥中的功能。circATG4B - 222aa逆轉TMED10誘導的CRC耐藥細胞凋亡和化療敏感性的增加（圖7A-B）。為進一步研究circATG4B - 222aa與TMED10在體內的功能聯系，將穩定轉染不同質粒的耐藥結直腸癌細胞移植瘤小鼠于第16天給予奧沙利鉑治療。過表達TMED10細胞組的腫瘤生長和重量均顯著下降，而過表達circATG4B - 222aa逆轉這種抑癌作用（圖7C-E）。這些結果表明circATG4B - 222aa可以通過與TMED10相互作用并增加自噬活性來誘導奧沙利鉑耐藥（圖7F）。

圖7在奧沙利鉑耐藥的CRC細胞中，Circatg4B - 222Aa逆轉Tmed10誘導的化療敏感性

結論:

綜上所述，研究發現奧沙利鉑耐藥的CRC細胞來源的上調的外泌體circATG4B可以轉移到受體細胞中，從而在受體細胞中誘導奧沙利鉑耐藥。此外，circATG4B編碼一個新的功能蛋白（circATG4B-222aa）。circATG4B-222aa在體內外均可促進CRC細胞自噬并誘導奧沙利鉑耐藥，但circATG4B本身并不促進自噬。此外，circATG4B - 222aa與TMED10存在競爭性相互作用，并作為誘餌阻止TMED10與ATG4B結合，導致自噬增加并誘導耐藥。總之，本研究證明circRNA在CRC耐藥獲得中的新機制。新型circATG4B - 222aa是重要的生物標志物，可能作為奧沙利鉑耐藥CRC的潛在治療靶點。

參考文獻

Pan Z, Zheng J, Zhang J, Lin J, Lai J, Lyu Z, et al. (2022) A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy. AdvSci (Weinh);9(35):e2204513. doi: 10.1002/advs.202204513.