腦轉移(BM)是惡性黑色素瘤(MM)的常見并發癥，生存期較差。預防BM可能比治療已確診的BM更有效和具有更好的耐受性。為了研究BM形成過程中PI3K/Akt/mTOR (PAM)通路激活的時空動態及其抑制的預防潛力，我們使用Akt生物傳感器進行體內分子成像，并通過小鼠慢性顱腦窗進行長期活體多光子顯微鏡觀察。體內分子成像顯示，在大腦定植的最初步驟中，PAM通路的激活是不變的。為了實現長期的血管內阻滯和外滲，循環MM細胞需要在這一過程中激活其PAM通路。然而，在已確診的人類腦轉移瘤中，PAM通路被相當不均一地激活，而其與腦滲透PAM抑制劑GNE-317的抑制作用僅在小鼠中產生中等的治療效果。相比之下，在預防計劃中給予包括極低劑量在內的GNE-317，有效地降低了兩個MM小鼠模型中BM的生長速度和數量，并導致總體生存效益。縱向活體多光子顯微鏡發現BM形成的第一個限速步驟—血管內永久阻滯、外滲和血管周圍初始生長—最容易受到PI3K/mTOR的雙重抑制。這些發現確立了PAM通路激活在早期轉移性腦定植的關鍵步驟中的關鍵作用，并揭示了其藥理抑制是預防臨床相關BM形成的有效途徑。本文于2022年2月發表于Neuro-Oncology (IF=13.029)上。

技術路線：

主要研究結果：

(1) Akt生物傳感器測量PAM通路調控的動態

為了全面了解PAM通路在腦轉移形成過程中的作用，我們在體內實時監測腫瘤細胞中腦轉移級聯每個后續步驟的PAM通路激活情況。腦轉移性A2058黑色素瘤細胞被用綠色熒光Akt生物傳感器轉導，在Akt刺激的情況下，該傳感器迅速從細胞核轉移到細胞質。首先，對Akt生物傳感器進行體外驗證。增殖細胞有傳感器的細胞質信號，表明Akt活性高，而接受穿透腦的雙重PI3K/mTOR抑制劑(GNE-317)或選擇性泛I類PI3K抑制劑(pictilisib)攻擊的細胞有表明Akt活性低的核信號(圖1A)。為了量化Akt活性，計算了GFP信號的細胞質/核比，結果證實了兩者之間的魯棒性差異(圖1B)。當GNE-317或pictilisib處理腫瘤細胞時，磷酸化(p)-S6RP、p-Akt和p-mTOR水平較低(圖1C)。在GNE-317和pictilisib處理的細胞中，流式細胞術檢測到較少的p-Akt (Ser473)(圖1D)。

圖1：Akt生物傳感器的建立和驗證，以測量PAM通路的激活。

(2) 循環腫瘤細胞在早期腦定植過程中迅速激活PAM通路

接下來，我們對腦定植癌細胞中PAM通路在腦轉移級聯的每個后續步驟中的動態調節進行研究。我們將表達RFP和Akt傳感器的A2058黑色素瘤細胞向小鼠心內注射，通過慢性顱窗通過重復活體多光子顯微鏡進行分子成像(圖2A)。在注射Akt活性較低的細胞群后的兩小時內，在大腦微血管中捕獲的腫瘤細胞中，約77%顯示出細胞質GFP信號，表明PAM通路被激活(圖2B)。成功外滲后，所有癌細胞均表現出較高的Akt活性(圖2B)。隨著時間的推移，對所有腫瘤細胞進行跟蹤發現，只有那些在血管內階段具有高Akt活性的細胞才能成功地外滲并定居血管周圍小龕(圖2C,D)。Akt活性低的血管內細胞(23%，n=16)不太可能獲得永久阻滯，且從未觀察到外滲事件(圖2D)。綜上所述，縱向監測體內PAM通路的激活表明，早在腦部腫瘤細胞停滯的血管內階段就開始的穩健和持久的PAM通路激活，對外滲和隨后的黑色素瘤腦轉移形成至關重要。

圖2：PAM通路激活是黑素瘤BM中一個不變的早期事件。

(3) 腦轉移瘤中PAM通路的異質性激活

通過分析轉移性MM(圖3A)和其他癌癥患者的組織芯片數據，確認了PAM通路在人類BM中的激活。這些已確診的人體BM在許多情況下顯示了PAM通路的激活，但激活模式相當不均一(圖3B)。結合生物傳感器研究和一項臨床試驗顯示，已確診BM的MM患者對PI3K抑制劑反應不足，這為在不同時間表中實驗測試GNE-317的BM抑制效果提供了明確的理論基礎。我們假設PAM通路抑制劑對BM形成的早期、決定命運的步驟有最強的影響，在這些步驟中PAM通路可能發揮最相關和一致的作用。

圖3：已確診的人類BM中Akt和mTOR信號通路。

(4) PI3K/mTOR雙重抑制對體外和體內黑色素瘤細胞的影響

接下來我們進行了體外和體內研究，以調查PAM通路抑制與BM形成的相關性。為了驗證腦穿透雙PI3K/mTOR抑制劑GNE-317在體內的靶向活性，進行了活體顯微鏡觀察，發現在活體小鼠大腦中轉移性癌細胞中存在特定的PAM通路抑制(圖4A)。由于癌細胞的增殖能力決定了大規模轉移的形成，進行了實時細胞分析增殖試驗，結果顯示，在GNE-317處理的H1和A2058黑色素瘤細胞中(圖4B)，以及在來自人類BM的原代黑色素瘤細胞系中(補充圖未展示)，增殖呈劑量依賴性減少。通過使用GNE-317進行體外處理，凋亡細胞的比例增加(補充圖未展示)。接下來，我們研究使用腦滲透雙PI3K/mTOR抑制劑GNE-317抑制PAM是否對臨床前環境中BM形成的早期步驟有效(圖4C)。通過反復活體多光子顯微鏡觀察A2058黑色素瘤細胞(表達細胞質RFP和核GFP)，在轉移級聯的每一步都可以檢測到細胞的增殖和存活(圖4D)。當小鼠在早期(從第4天開始)接受GNE-317治療時，與模擬治療的對照組相比，生長速率顯著降低，個別微轉移病灶的存活率也顯著降低(圖4E,F)。這些數據證實，高、最大耐受劑量的GNE-317 (25 mg/kg/d)能夠對整個腦轉移級聯產生有意義的影響，并從大腦定植的最初步驟起就靶向黑素瘤細胞。

圖4：PI3K/mTOR雙抑制劑對體外和體內黑色素瘤細胞的影響。

(5) PAM通路抑制劑對腦轉移的顯著預防作用

我們研究了早期應用一種培養基甚至極低劑量的GNE-317是否能在兩種黑色素瘤BM模型中實現體內預防BM。使用長期重復的室內多光子顯微鏡，監測了四組小鼠的BM發展情況：在中(12.5 mg/kg/d)或低(2.5 mg/kg/d)劑量預防性方案中接受GNE-317的小鼠與在BM已經形成時開始接受中劑量(12.5 mg/kg/d)治療方案的小鼠(圖5A)。然后用小鼠模型來檢驗這個假設。高血糖是PAM抑制劑常見的臨床副作用。與對照組相比，中劑量的GNE-317導致我們小鼠模型的血糖顯著升高(圖5B)。相比之下，低劑量的GNE-317對血糖水平沒有顯示出任何顯著的影響，這表明降低劑量確實可以減少PAM通路抑制劑的關鍵副作用。

在心內注射后第28天，活體多光子顯微鏡顯示，H1和A2058模型的腦膜尺寸在預防計劃中減小(圖5C)。兩組預防方案似乎都有效地阻止了小微轉移期的轉移(圖5D)。對腫瘤形成4周內腫瘤生長速率的量化顯示，與對照組相比，兩種預防計劃確實有效地阻止了腫瘤細胞增殖，在第一周效果最強，甚至可觀察到腫瘤體積的暫時減少(圖5E)。低劑量和中劑量預防方案組的BM生長抑制效果相當(圖5E)。第二個H1黑色素瘤模型證實了預防低劑量的強烈影響(補充圖未展示)。與預防方案的結果相反，12.5 mg/kg/d的GNE-317治療已建立的轉移瘤僅對已建立的腦轉移瘤的生長產生中等影響(圖5C-E)，這與使用PI3K抑制劑buparlisib治療MM患者時對已建立的腦轉移瘤無反應一致。這些數據表明，在大腦定植的早期階段開始使用GNE-317低劑量給藥具有顯著的好處。

圖5：預防vs治療計劃。

(6) 縱向活體成像揭示確切的藥物作用

接下來，揭示雙PI3K/mTOR抑制影響的腦轉移級聯的確切步驟。當比較注射后3天血管停止到實驗結束期間轉移病灶的總體生存期時，低劑量預防計劃導致轉移病灶數量隨著時間的推移而減少(圖6A)。對照組和治療組(治療從第21天開始)之間沒有觀察到顯著差異(圖6A)。在第3天和第7天之間觀察到預防性計劃對轉移病灶數量的最強減少(圖6A)。與對照組相比，在低劑量預防組中，黑色素瘤細胞外溢到第7天的數量較少(圖6B,C)。追蹤每個轉移病灶的去向發現，與對照組相比，預防治療組小鼠血管周圍小龕中A2058黑色素瘤細胞的數量顯著減少(32.1% vs 77.1%)，同時形成較少的BM (20.2% vs 63.7%)(圖6D)。這在第二個黑色素瘤模型中得到了證實(圖6D)。在低劑量預防組與治療組之間也發現了類似的差異(補充圖未展示)。由于治療組的雙PI3K/mTOR抑制只在外滲后才開始，因此該組可視為本實驗的第二個獨立對照組。因此，預防性治療的效果是雙重的：血管外滲和血管周圍生態位的早期定位點都受到PAM通路抑制的影響(圖6B-D)。在中劑量預防計劃組和低劑量預防計劃組之間，已確定轉移的形成再次沒有顯著差異(補充圖未展示)。

最后，通過縱向全身生物發光成像和一項生存研究來證實PAM通路抑制的抗轉移作用。預防方案中低劑量的GNE-317顯著減少了腦內外的轉移負擔，然而，觀察到對顱內轉移的作用最強(圖6E)。低劑量預防計劃顯示了特別強的生存效益(圖6F)。停止給藥GNE-317后，轉移瘤生長加速(補充圖未展示)，這說明持續低劑量給藥可最大程度抑制腦轉移瘤。

圖6：腦轉移級聯的早期步驟最容易受到PAM通路的抑制。

結論：

總之，低劑量腦穿透性PI3K/mTOR雙重抑制劑對預防腦轉移尤其有效，使這種方法成為未來高危MM患者腦轉移預防試驗的可行之路。通過一種耐受性良好的藥物，可長期服用，有效地預防腦轉移，可能會在未來對癌癥患者產生真正的影響。

參考文獻：

Tehranian, C., Fankhauser, L., Harter, P. N., Ratcliffe, C., Zeiner, P. S., Messmer, J. M., Hoffmann, D. C., Frey, K., Westphal, D., Ronellenfitsch, M. W., Sahai, E., Wick, W., Karreman, M. A., & Winkler, F. (2022). The PI3K/Akt/mTOR pathway as a preventive target in melanoma brain metastasis. Neuro-oncology, 24(2), 213–225. https://doi.org/10.1093/neuonc/noab159.