食管癌是一種全球致命的癌癥，5年生存率為18%。目前環狀RNA(circRNAs)已被證實有助于食管癌的進展。在本研究中，作者通過生物信息學分析預測circBCAR3(hsa_circ_0007624)在食管癌中存在差異表達，進而研究circBCAR3在食管癌發生中的致癌作用和生物發生。該研究于2022年7月發表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。

技術路線：

主要研究結果：

1. CircBCAR3在食管癌組織和細胞中表達上調

為了解circBCAR3在食管癌中的表達情況，首先從GEO數據庫中分析了circRNAs在食管癌中的表達情況?；贕SE150476和GSE112496數據集，食管癌中存在5種差異表達的circRNAs(圖1A)。在EC109細胞中，缺氧治療后只有hsa_circ_007624表達上調(圖1B)。PCR結果顯示hsa_circ_0007624(circBCAR3)在食管腫瘤組織和細胞系中表達明顯升高，證實circBCAR3表達上調(圖1C和D)。將BCAR3 pe-mRNA的2，3，4，5外顯子反向剪接，形成circBCAR3的閉環結構(圖1E)。作者檢測了circBCAR3和線性BCAR3與RNase R的穩定性，環狀形式(circBCAR3)對RNase R的抗性更強，而線性形式(BCAR3 mRNA)顯著衰減(圖1F)。此外，經轉錄抑制劑Actinomycin D處理后，circBCAR3的轉錄半衰期長于BCAR3 mRNA，這表明circBCAR3的穩定性高于BCAR3 mRNA(圖1G)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析從EC109和KYSE150細胞中分離cDNA和gDNA。利用cDNA而非gDNA中的不同引物擴增circBCAR3，證實環狀BCAR3外顯子的存在，排除了反式剪接產物(圖1H)。隨后對EC109和KYSE150細胞進行了RNA-FISH檢測，結果顯示circBCAR3主要存在于食管癌細胞的細胞質中(圖1I)。

圖1. CircBCAR3在食管癌中表達上調

2. 敲低circBCAR3可抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲

探討circBCAR3在食管癌發生發展中的作用，在EC109和KYSE150細胞中，作者設計了兩種shRNAs來有效地沉默circBCAR3(圖2A)。CCK-8、克隆形成實驗和EdU實驗結果顯示，沉默的circBCAR3抑制了EC109和KYSE150細胞的活力和增殖(圖2B-D)。創面愈合試驗和transwell試驗(包括遷移和侵襲)表明，circBCAR3的下調抑制了食管癌細胞的遷移和侵襲能力(圖2E和F)。

圖2. 沉默circBCAR3在體外可抑制食管癌細胞的增殖和運動

3. 敲低circBCAR3可抑制食管癌細胞的鐵死亡

接下來，作者進一步探討敲低circBCAR3對鐵死亡的影響。如圖3A-D所示，sh-circBCAR3降低了細胞內Fe2+、MDA、脂質ROS，并增加了GSH水平。透射電鏡觀察sh-circBCAR3在食管癌細胞中還原鐵死亡的典型形態變化(圖3E)。如圖3F所示，沉默circBCAR3后，GPX4蛋白水平升高。因此，circBCAR3的敲低可抑制食管癌細胞的鐵死亡。

圖3. 沉默circBCAR3在體外可抑制食管癌細胞的鐵死亡

4. 敲低circBCAR3可逆轉缺氧對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的影響

再次進行功能研究，以評估circBCAR3是否介導缺氧誘導的食管癌細胞惡性行為的改變。結果表明，缺氧處理可顯著促進食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，CircBCAR3基因的下調明顯逆轉了缺氧的這些影響(圖4)。

圖4. 敲低circBCAR3可逆轉缺氧對體外食管癌細胞的影響

5. 沉默circBCAR3在體內可抑制食管癌的腫瘤生長和轉移

如圖5A-C，結果表明敲低circBCAR3可降低小鼠食管腫瘤的體積和重量。此外，免疫組化染色結果表明，沉默的circBCAR3可降低增殖標志物ki67的表達。H&E染色結果顯示，sh-nc組腫瘤細胞分布密集，細胞形態正常，而sh-circBCAR3組腫瘤細胞數量減少，細胞核縮小較多(圖5D)。隨后，作者建立腫瘤轉移模型，通過尾靜脈注射食管癌細胞來監測肺轉移。生物發光強度的下降證明沉默的circBCAR3誘導小鼠腫瘤抑制(圖5E)。與對照組相比，沉默circBCAR3對食管癌肺轉移有抑制作用(圖5F)。H&E染色結果進一步證實了這一趨勢(圖5G)。免疫組化染色揭示敲除circBCAR3可抑制肺組織中vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表達，促進E-cadherin的表達(圖5H)。這些數據表明，在體內敲低circBCAR3可抑制食管癌的生長和轉移。

圖5. 敲低circBCAR3在體內可抑制食管癌的生長和轉移

6. 在食管癌細胞中，circBCAR3負向調控miR-27a-3p

從ENCORI數據庫中預測與circBCAR3結合的潛在miRNAs。miR-27a-3p與circBCAR3的結合位點如圖6A所示。熒光素酶實驗結果顯示，circBCAR3負調控野生型miR-27a-3p，與突變型miR-27a-3p無結合關系(圖6B)。RIP實驗發現，Ago2是miRNA機制的效應物，可與miR-27a-3p和circBCAR3結合(圖6C和D)。轉染circBCAR3 shRNAs到EC109和KYSE150細胞，miR-27a-3p表達水平升高，而過表達circBCAR3降低了miR-27a-3p的表達水平(圖6E)。此外，為確定circBCAR3和miR-27a-3p在食管癌細胞中的亞細胞分布，作者進行了RNA-FISH實驗，結果表明circBCAR3和miR-27a-3p均位于細胞質中(圖6F)。

圖6. CircBCAR3在食管癌細胞中充當miR-27a-3p的海綿

7. TNPO1在食管癌細胞中作為miR-27a-3p的靶點

通過ENCORI數據庫，確定TNPO1、GCC2、THRB和CASC3為miR-27a-3p的潛在靶點。圖7A結果表明，miR-27a-3p可引起TNPO1在EC109細胞中的表達降低。與對照Het-1A細胞系相比，6個食管癌細胞中TNPO1表達顯著上調(圖7B)。從GEPIA數據庫中發現，TNPO1在182個食管癌組織中表達高于286個相鄰非腫瘤組織(圖7C)。根據ENCORI數據庫預測，TNPO1 3'UTR與miR-27a-3p序列互補(圖7D)。構建TNPO1 3'UTR野生型和突變型熒光素酶報告基因進行熒光素酶實驗，證實TNPO1是miR-27a-3p的直接靶點(圖7E)。MiR-27a-3p模擬物能有效降低TNPO1的表達水平，而miR-27a-3p抑制劑能顯著增強TNPO1的表達水平(圖7F)。缺氧可誘導食管癌細胞中TNPO1表達上調(圖7G)。PCR結果顯示，與45個癌旁非腫瘤組織相比，TNPO1在45個食管癌組織中顯著高表達(圖7H)。

圖7. TNPO1在食管癌細胞中作為miR-27a-3p的靶點

8. 過表達TNPO1可拯救沉默circBCAR3介導的對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的抑制

作者設計了TNPO1過表達載體，發現它有效地拯救了sh-circBCAR3對TNPO1表達的抑制作用(圖8A)。集落形成實驗和EdU實驗表明，circBCAR3 shRNA降低細胞活力和增殖，TNPO1過表達進一步提高細胞活力和增殖(圖8B和C)。Transwell遷移和侵襲實驗表明，TNPO1過表達挽救了敲低circBCAR3對細胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖8D)。圖9顯示sh-circBCAR3對食管癌細胞鐵死亡的抑制作用被TNPO1的過表達所拯救，pcDNA-TNPO1-誘導細胞內Fe2+、MDA、脂質ROS升高，GSH和GPX4水平降低。

圖8. TNPO1可逆轉circBCAR3沉默誘導的對食管癌細胞增殖和活力的抑制

圖9. TNPO1挽救sh-circBCAR3誘導的食管癌細胞鐵死亡抑制

9. 剪接因子QKI加速circBCAR3的生物發生

PCR分析結果顯示，剪接因子QKI和ESRP1對食管癌細胞中circBCAR3的表達有負調控作用，而其他剪接因子對circBCAR3的表達無顯著影響(圖10A)。接下來展示了5個QKI結合序列位于BCAR3 pre-mRNA外顯子的兩側(圖10B)。RIP試驗使用QKI抗體證明QKI與BCAR3 pre-mRNA在a，b，d和e位點結合(圖10C)。此外，QKI在收集的45個食管癌組織中表達上調(圖10D)。敲低QKI可以抑制circBCAR3的表達，對BCAR3 mRNA的表達無影響(圖10E)。這些發現表明，剪接因子QKI通過內含子中的結合位點加速了circBCAR3的生物發生。

圖10. 剪接因子QKI加速circBCAR3的生物發生

10. 缺氧誘導E2F7表達激活QKI轉錄

作者已經證實，circBCAR3在食管癌中高表達，并通過缺氧治療上調表達。缺氧如何誘導circBCAR3表達升高尚不清楚。因此，進行RNA-seq篩選異常基因，如熱圖和火山圖所示(圖11A和B)。富集分析顯示E2F家族的基因被富集(圖11C)。通過檢索GEPIA數據庫來探討這些E2Fs在食管癌中的表達，發現E2F7在食管癌中顯著高表達(圖11D)。PCR分析證實，缺氧后EC109細胞E2F7和QKI表達均上調(圖11E)。由于E2F7是一個轉錄激活因子，推測E2F7可能調控QKI的轉錄。在QKI的啟動子中，基于JASPR在線數據庫發現了一個E2F7的潛在結合位點(圖11F)。隨后，將該結合位點的野生和突變形式亞克隆到pGL3載體中。熒光素酶測定后，結果表明，E2F7對攜帶野生結合位點的報告載體熒光素酶活性有促進作用，但對突變位點無促進作用(圖11G)。此外，E2F7基因敲除降低了QKI mRNA表達水平(圖11H)。檢索GEPIA數據庫，在182個食管癌組織中檢測這些關鍵分子的表達相關性，結果顯示E2F7和QKI，E2F7和TNPO1，QKI和TNPO1兩者之間存在正相關表達(圖11I)。

圖11. 缺氧誘導E2F7激活QKI的轉錄

結論：

作者創新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用，通過促進癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡以及促進小鼠食管癌的發生和轉移。在分子水平上，缺氧誘導的E2F7轉錄激活剪接因子QKI，通過與內含子結合促進circBCAR3的生物發生形成circBCAR3外顯子側面的QKI響應元件。CircBCAR3與miR-27a-3p相互作用上調TNPO1，從而在食管癌細胞中發揮其生物學功能。這些數據表明，circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標志物。