垂體腺瘤（NFPA）是最常見的顱內腫瘤之一。CircRNA通過充當miRNA海綿和蛋白質支架或編碼功能性蛋白質在多種生物過程中發揮重要作用。然而，circRNA在NFPA進展中的作用尚不清楚。在本文中，CircVPS13C在NFPA樣本和細胞系中顯著上調。功能獲得和功能喪失實驗表明，在體外和體內，沉默circVPS13C抑制垂體瘤細胞的增殖。在機制上，circVPS13C沉默增加IFITM1的表達，并隨后激活其參與MAPK和凋亡相關信號通路的下游基因。拯救實驗表明IFITM1的過表達部分逆轉了circVPS13C的生物學效應。進一步研究表明，circVPS13C通過與RRBP1競爭性相互作用抑制IFITM1的表達，從而減輕IFITM1 mRNA的穩定性。臨床上，高風險NFPA樣本中circVPS13C的表達明顯較高，經蝶竇腺瘤切除術后7天患者血清中circVPS13C表達下調。我們的研究結果表明，circVPS13C通過一種新的機制，即通過與內質網膜上的核糖體結合蛋白相互作用來調節mRNA的穩定性在NFPA的增殖和發育中起著關鍵的調節作用。本文于2022年1月發表于Oncogene（IF=9.867）上。

技術路線

結果

1）NFPA樣本中circVPS13C表達顯著增加

使用CircRNA微陣列比較年齡和性別配對的NFPA和NP組織的CircRNA表達譜。微陣列強度值的箱線圖顯示樣本之間的差異較小，表明兩組之間的circRNA表達模式相似（圖1a）。熱圖（圖1b）和火山圖（圖1c）用于顯示兩組中差異表達的CircRNA。兩組共有1493個circRNAs差異表達。其中，在NFPA樣本中，990個顯著上調，503個顯著下調。我們重點研究了具有較高絕對表達水平的上調circRNA。我們選擇了其中10個circRNAs進行進一步研究，因為據報道它們的親本基因參與細胞增殖的調節。與NP組織相比，NFPA樣本中的所有circRNAs均被證實顯著上調（圖1d）。然后，選擇qRT-PCR周期閾值最低的前5個circRNAs，采用CCK-8法評價其在垂體腫瘤衍生濾泡星狀細胞(PDFS)中的生物學功能。如圖1e所示，circVPS13C沉默后對細胞增殖的抑制效果最好。綜上所述，這些結果促使我們進一步研究circVPS13C在NFPA發生和發展中的作用。

2）circVPS13C在垂體腺瘤細胞中的鑒定與驗證

CircVPS13C轉錄自VPS13C基因位點，位于人類第15號染色體上。其長度為608 bp，包含8-13外顯子。為了確認circVPS13C是一個circRNA，我們進行了Sanger測序來識別頭尾剪接(圖2a)。然后，設計不同的引物，以PDFS細胞中提取的cDNA或gDNA為模板，擴增內源性circVPS13C的頭尾剪接位點(圖2b)。最后，RNase R耐受試驗和瓊脂糖電泳分析證實circVPS13C對RNase R耐受(圖2c)。綜上所述，這些數據證實了circVPS13C是一個真正的circRNA。為了表征circVPS13C的亞細胞位置，我們用RNA-FISH方法對circVPS13C進行了測定，發現在PDFS細胞中，circVPS13C在細胞質和核中都富集。亞細胞分離分析和半定量PCR進一步驗證了circVPS13C在細胞質和核中的富集(圖2d)。此外，我們用RNA-FISH檢測了circVPS13C在NFPA和正常垂體樣本中的分布。與qRT-PCR檢測結果一致，circVPS13C染色在NFPA樣本中比在正常垂體組織中更集中(圖2e)。

3）CircVPS13C沉默部分通過增加凋亡抑制NFPA細胞的增殖

為了評價circVPS13C在NFPA發育中的生物學功能，我們利用PDFS和人源性NFPA原代細胞進行了功能獲得和功能喪失實驗。結果顯示，circVPS13C的表達被兩種shRNAs有效地沉默，在轉染circVPS13C載體的PDFS細胞中穩定上調(圖3a)。CCK-8實驗顯示，沉默circVPS13C顯著削弱了PDFS細胞和人源NFPA細胞的增殖，而過表達circVPS13C則有相反的效果(圖3b)。然后，我們進一步確定了circVPS13C對另外6個人源性NFPA原代細胞的影響。CCK-8實驗顯示，在培養72 h后，circVPS13C沉默均顯著抑制了它們的生長(圖3c)。同樣，敲低circVPS13C后，PDFS細胞的集落形成也受到明顯抑制(圖3d)。此外，流式細胞術凋亡檢測顯示，在circVPS13C敲低的細胞中，凋亡細胞的比例顯著增加，而在過表達circVPS13C的細胞中，凋亡細胞的比例顯著降低(圖3e)。為了進一步證明circVPSC13C對垂體腺瘤細胞的作用，我們評估了circVPSC13C對MAPK信號通路的影響，該通路已被證明在包括垂體腺瘤在內的各種腫瘤的細胞增殖中發揮重要作用。一致地，circVPS13C沉默降低了體外Bcl-2、 pERK1/2和p-P38的蛋白水平，增加了cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Bax的蛋白水平。CircVPS13C過表達產生了相反的效果(圖3f)。最后，為了確定circVPS13C在體內是否影響NFPA細胞的增殖，我們將轉染了circVPS13C表達載體或sh-circVPS13C的PDFS細胞注射到裸鼠皮下組織。從circVPS13C敲低細胞中生長的腫瘤明顯比從對照細胞中生長的腫瘤更小更輕(圖3g)。綜上所述，沉默circVPS13C可以抑制體外和體內NFPA細胞的增殖，部分原因是通過增加凋亡。

4）CircVPS13C沉默部分通過上調IFITM1表達來抑制細胞增殖

為了研究circVPS13C對NFPA細胞生物學效應的潛在機制，我們對三對circVPS13C沉默的PDFS細胞和對照細胞進行了mRNA-seq分析。結果顯示，沉默circVPS13C后，共有429個基因顯著上調，19個基因下調(圖4a)。在15個NFPA和8個NP樣本中進一步驗證了表達增加最多的前10個基因和表達減少最多的9個基因，IFITM1是變化最顯著的基因之一(圖4b)。據報道，IFITM1已被廣泛描述參與細胞增殖和遷移。此外，18個樣品的western blot和43個NFPA樣品的qRT-PCR均證實IFITM1表達下調(圖4c)，在43個NFPA樣本中，circVPS13C和IFITM1顯著負相關(圖4d)。qRT-PCR和western blotting分析表明，circVPS13C基因的下調增加了IFITM1的表達，而circVPS13C過表達則產生相反的結果（圖4e）。為了確定circVPS13C對NFPA細胞的生物學效應是否通過抑制IFITM1介導，我們進行了一項涉及circVPS13C和IFITM1的拯救實驗。結果顯示，敲低IFITM1可以部分逆轉circVPS13C敲低對PDFS細胞增殖和集落形成的抑制作用(圖4f-h)。此外，IFITM1的敲除在一定程度上逆轉了circVPS13C沉默對凋亡相關蛋白和MAPK通路中蛋白水平的影響(圖4i)。總的來說，circVPS13C沉默部分通過增強IFITM1的表達來抑制NFPA細胞的生長。

5）circVPS13C通過與RRBP1相互作用降低IFITM1 mRNA的穩定性，從而抑制其表達

我們試圖研究circVPS13C如何調節IFITM1的表達。我們進行了ChIRP分析，以識別潛在的circVPS13C相關蛋白，如圖5a所示。ChIRP-qPCR驗證，circVPS13C-sense探針在處理組的富集效率比NC組高104倍(圖5b)。應用瓊脂糖電泳和銀染色對circVPS13C RNA相關蛋白進行鑒定，發現anti-circVPS13C探針組與NC探針組有明顯不同的陽性信號。然后采用LC-MS/MS法對陽性樣品中的蛋白進行鑒定(圖5c)。在circVPS13C-sense探針組中富含的蛋白中，RRBP1因其在circVPS13C-sense探針組中表達量高而備受關注，因為已有報道稱RRBP1與多種惡性腫瘤的發生有關。我們用ChIRP-western blot進一步證實了這一結果(圖5d)。然后，我們檢測RRBP1是否參與調節IFITM1的表達。如圖5e所示，RRBP1沉默后IFITM1 mRNA和蛋白水平均顯著降低，而RRBP1過表達細胞IFITM1 mRNA和蛋白水平升高。同樣，經western blotting證實，RRBP1過表達增加了IFITM1的水平，并部分挽救了circVPS13C對IFITM1表達的抑制(圖5f)。先前的研究證實RRBP1是一種位于內質網膜上的蛋白，可以調節mRNA的穩定性，增強mRNA與核糖體的結合，促進翻譯。放線菌素D抑制細胞轉錄后，在不同時間提取總RNA進行qPCR檢測IFITM1 mRNA的穩定性。結果表明，當RRBP1沉默或circVPS13C過表達時，IFITM1 mRNA的降解顯著加快。過表達RRBP1部分消除了circVPS13C對IFITM1 mRNA的影響(圖5g)。綜上所述，circVPS13C可能通過與RRBP1相互作用部分調控IFITM1的表達。

6）CircVPS13C通過與RRBP1競爭性相互作用抑制IFITM1的表達

我們探究circVPS13C如何與RRBP1相互作用抑制IFITM1的表達。circVPS13C表達的增加和減少并沒有引起RRBP1蛋白水平的顯著變化(圖6a)。同樣，RRBP1和circVPS13C mRNA表達在NFPA樣本中也沒有顯著相關性。這些數據表明circVPS13C不太可能調控RRBP1的表達。RIP-qPCR結果顯示，circVPS13C過表達增加了circVPS13C與RRBP1的相互作用水平，但降低了IFITM1與RRBP1的相互作用水平，并伴隨著降低IFITM1 mRNA的表達。CircVPS13C的沉默產生了相反的效果。因此，我們推斷circVPS13C通過與RRBP1競爭性相互作用抑制IFITM1的表達。RIP-qPCR結果顯示，與RRBP1WT和circVPS13C的互作水平相比，RRBP1T554A + Q551A和circVPS13C的互作水平顯著降低(圖6d)。然后，我們用質粒RRBP1T554A + Q551A和RRBP1WT轉染PDFS細胞進行共定位檢測。熒光共定位結果顯示，circVPS13C和RRBP1WT蛋白共定位于PDFS細胞的細胞質中，但未檢測到與RRBP1T554A + Q551的共定位(圖6e)。這些結果表明RRBP1通過GLN551和THR554殘基與circVPS13C相互作用。RRBP1- circVPS13C復合物的模擬結構和詳細的殘基相互作用如圖6f所示。

7）circVPS13C在NFPA中的臨床意義

通過qRT-PCR檢測93個NFPAs和23個年齡和性別配對的NP組織中circVPS13C的水平。如圖7a所示，與正常組織相比，circVPS13C在NFPA組織中表達明顯升高，且幾乎在所有NFPA樣本中circVPS13C表達均上調。然而，與正常垂體組織相比，circVPS13C在分泌GH腺瘤和催乳素瘤中表達水平沒有明顯改變，而在TSH腺瘤中表達下調(圖7b)。接著，我們分析臨床因素對circVPS13C表達的影響。circVPS13C在Knosp的IV級樣本(圖7c)和較大的腫瘤(圖7d)中表達更高。我們發現與其他腫瘤相比，circVPS13C在沉默的皮質滋養腺瘤中的平均表達明顯更高(圖7e)。更有趣的是，術后7天circVPS13C在患者血清中的表達下調(圖7f)。此外，血清circVPS13C水平與腫瘤樣本中的circVPS13C水平相關，并與腫瘤直徑顯著相關(圖7g)。同時，上清circVPS13C水平與PDFS細胞內表達及培養時間顯著相關(圖7h)。綜上所述，circVPS13C特異性地結合并隔離RRBP1，通過促進IFITM1 mRNA的降解降低IFITM1的表達，從而最終促進NFPA的增殖(圖7i)。

結論：
   CircVPS13C在NFPA樣本中顯著上調，并與NFPA的侵襲性特征相關。通過與RRBP1的競爭性相互作用，circVPS13C的沉默降低了IFITM1 mRNA的穩定性，從而抑制了NFPA細胞的生長。CircVPS13C是NFPA增殖和發展的關鍵調控因子，提示其可能成為NFPA管理的診斷因子和治療靶點。

參考文獻：

Zhang W, Chen S, Du Q, Bian P, Chen Y, Liu Z, Zheng J, Sai K, Mou Y, Chen Z, Fan X, Jiang X. CircVPS13C promotes pituitary adenoma growth by decreasing the stability of IFITM1 mRNA via interacting with RRBP1. Oncogene. 2022 Mar;41(11):1550-1562. doi: 10.1038/s41388-022-02186-0.