大量研究顯示m6A修飾可以增強mRNA或lncRNA結合miRNA的能力。但是其對circRNA結合miRNA的影響尚不清楚。本研究證實m6A修飾circALG1可增強其結合miR-342-5p和能力進而促進結直腸癌的轉移。本研究于2022年3月發表在《Molecular Cancer》IF: 27.401期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、circALG1在CRC中高表達

circRNA的芯片分析結果顯示，和癌旁組織比較，有353個circRNAs在CRC組織中顯著上調（圖1A），54個circRNAs相比于健康對照在CRC患者外周血中顯著上調（圖1B）。對兩種方法獲得的差異表達circRNAs取交集，鑒定到兩個circRNAs，分別是circALG1和circCOL6A3（圖1C）。隨后利用在線網站SRAMP預測這兩個circRNA是否發生m6A修飾，結果發現都發生，但由于在CRC患者的組織和外周血中circALG1的整體表達水平高于circCOL6A3，所以作者選擇了circALG1作為后續研究的重點。此外，使用GEO中的GSE126094數據集進行驗證，發現circALG1在CRC癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（圖1D）。為進一步確定circALG1在結直腸癌中的表達水平，收集了40對結直腸癌患者的癌旁組織、20例結直腸癌患者術前和術后1周的血液標本以及15例健康個體的外周血標本進行qRT-PCR檢測。結果顯示circALG1在CRC癌組織和外周血中均顯著高表達（圖1E-1F）。有趣的是，circALG1的表達在CRC術后一周的患者外周血中顯著下降（圖1G）。ROC曲線顯示circALG1在結直腸癌患者癌組織和癌旁組織、結直腸癌患者外周血及健康人群外周血、結直腸癌患者術前、術后外周血的表達水平均有較好的區分（圖1H-1J）。

圖1 circRNA的表達譜揭示circALG1在CRC中高表達

2、CRC細胞中circALG1的特征

針對circALG1形成環的位點作者設計了一種聚合引物和一種發散引物。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，聚合引物在cDNA和gDNA中均擴增出條帶，而發散引物僅擴增出cDNA的條帶，進一步的cDNA測序發現環狀位點的存在(圖2A)，表明circALG1是環狀的。親本基因ALG1 mRNA相比，circALG1表現出對RNase R消化的抗性（圖2B）。放線菌素處理后，細胞中circALG1的降解速度明顯慢于ALG1 mRNA的降解速度，表明circALG1是穩定的（圖2C）。核質分離實驗和FISH實驗表明circALG1主要定位于細胞質（圖2D-2E）。

圖2 CRC細胞中circALG1的表征

3、circALG1在體內外促進CRC的轉移

作者檢測了5中細胞系中circALG1的表達，發現其表達在HCT116中的最低，在SW480中最高，所以候選選擇這兩個細胞進行實驗。在HCT116中構建circALG1穩定過表達的細胞株，在SW480中構建circALG1穩定干擾的細胞株。結果顯示過表達circALG1后細胞的遷移和侵襲水平顯著增強，沉默circALG1表達則相反（圖3A-3B）。同時，作者構建了ALG1過表達和敲除的對照細胞株，但結果顯示無論是過表達還是干擾ALG1對CRC細胞遷移和侵襲都無顯著影響。表明線性ALG1不影響circALG1的功能。此外，在體內腫瘤轉移模型中，過表達circALG1的小鼠顯示出更多的肝和肺轉移結節，沉默circALG1則相反（圖3-3D）。這些結果說明circALG1與CRC轉移相關。

圖3 circALG1促進CRC的體內轉移

4、m5A修飾circALG1增強CRC細胞的侵襲和遷移能力

通過在線網站SRAMP，發現circALG1極有可能發生m6A修飾，此外，甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)檢測中觀察到circALG1的富集，這證實了circALG1確實經歷了m6A修飾（圖4A）。隨后研究circALG1 m6A修飾水平對circALG1功能的影響，通過突變circALG1中兩個最有可能的m6A修飾位點后，構建其野生型和突變型質粒（圖4B）。用同樣數量的野生型和突變型質粒轉染circALG1穩定沉默的SW480細胞株。qRT-PCR分析顯示，不同組circALG1表達水平無差異（圖4C）；當一個位點發生突變時，細胞內m6a修飾的circALG1水平降低，而當兩個位點發生突變時，細胞內未觀察到m6a修飾的circALG1水平（圖4D）。功能實驗表明，circALG1的m6A位點突變降低了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力（圖4E）。這些結果表明，circALG1 m6A修飾水平與CRC細胞的遷移和侵襲能力呈正相關。

圖4 m5A修飾的circALG1促進CRC細胞的轉移

5、circALG1通過miR-342-5p促進CRC細胞的侵襲和遷移

作者利用在線軟件預測到5個可能和circALG1結合的miRNAs，利用雙熒光素酶探究了他們與circALG1之間的結合關系，結果顯示，只有miR-342-5p的熒光活性相比于對照組顯著下降（圖5A），提示circALG1和miR-342-5p之間可能存在結合關系。如圖5B所示，構建circALG1和miR-342-5p結合位點突變的circALG1質粒和野生型質粒，檢測熒光素酶活性，結果顯示共轉染circALG1野生型質粒和miR-342-5p mimics時，熒光素酶活性顯著下降，而共轉染circALG1野生型質粒和miR-342-5p inhibitor時，則增強熒光素酶活性（圖5B）。此外，在circALG1突變組熒光素酶活性不因miR-342-5p改變。這些結果表明circALG1可特異性結合miR-342-5p。在circALG1的RAP實驗中，觀察到miR-342-5p的顯著富集（圖5C）。功能性實驗表明過表達miR-342-5p可以逆轉circALG1過表達對CRC細胞遷移和侵襲的增強作用（圖5D）；抑制miR-342-5p則可以逆轉circALG1沉默對CRC細胞遷移和侵襲的抑制作用。這些說明circALG1通過海綿吸附miR-342-5p促進CRC細胞的侵襲和遷移。

圖5 circALG1通過miR-342-5p促進CRC細胞的侵襲和遷移

6、PGF是circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因

為了探究circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因，作者對沉默circALG1前和沉默后的SW480細胞進行RNA測序?？傆嫬@得76個差異表達基因，其中有7個與miR-342-5p的預測靶基因重疊（圖6A）。通過UALCAN進一步分析發現只有PGF的表達在CRC腫瘤組織中顯著上調，并與不良預后相關，并且在本實驗的CRC臨床樣本中PGF也在CRC中顯著上調（圖6B-6D）。

相關性分析結果顯示PGF的表達和miR-342-5p的表達負相關（圖6E）。雙熒光素酶實驗也證實PGF和miR-342-5p之間的存在直接結合關系（圖6F）。進一步研究發現PGF在5株細胞系中的表達趨勢和circALG1一致。因而在SW480中進行PGF沉默表達的功能缺失實驗，在HCT116中進行PGF過表達的功能獲得實驗，結果和預期一致，PGF沉默抑制細胞的侵襲和遷移，過表達則相反（圖6G-6H）。隨后發現過表達PGF可以顯著上調ERK的磷酸化水平并激活上皮間質轉化相關基因的表達，沉默PGF的表達結果則相反（圖6I）。

回復實驗結果顯示，PGF沉默逆轉了因circALG1過表達或miR-342-5p抑制導致的HCT116細胞遷移和侵襲的增強；反過來PGF過表達同樣可逆轉因circALG1抑制或miR-342-5p過表達導致的HCT116細胞遷移和侵襲的減弱（圖6J-6K）。在CRC臨床樣本中，同樣可觀察到PGF的高表達，以及上調的ERK磷酸化和激活的上皮間質轉化基因的表達（圖6L）。

綜上所述，PGF是circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因。

圖6 PGF是circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因

7、m6A修飾circALG1增強其結合miR-342-5p的能力

為研究m6A修飾對circALG1功能的影響，進行了circALG1的RAP實驗使用SW480細胞，在該細胞中提前轉染了circALG1的野生型載體和m6A修飾位點突變的載體。結果顯示，circALG1中m6A修飾的減少減弱了其與miR-342-5p的結合（圖7A）。隨后構建類似的雙熒光素酶質粒即circALG1上m6A修飾位點突變或不突變的質粒。結果顯示circALG1 m6A修飾位點的突變增強了miR-342-5p mimics組熒光素酶的表達，熒光強度增加，當兩個m6A修飾位點都發生突變時，熒光強度最高，但在mimics NC組熒光素酶強度不受circALG1上m6A修飾位點突變的影響（圖7B）。這些結果表明，miR-342-5p mimic對含有m6A修飾位點突變序列的circALG1的螢火蟲熒光素酶質粒表達的抑制作用減弱，提示circALG1與miR-342-5p的結合受m6A修飾的調控。

然后研究了m6A修飾影響circALG1與miR-342-5p結合的具體機制。文獻表明，circRNA m6A修飾的功能往往需要m6A修飾相關蛋白的參與。對circALG1 RAP中拉下的蛋白進行MS檢測，YTHDF1在m6A修飾相關蛋白中富集最高；因此，初步選擇該蛋白作為研究重點（圖7C）。此外，我們在YTHDF1 RIP實驗中檢測到circALG1的富集（圖7D）。當circALG1 m6A修飾位點發生突變時，YTHDF1的RIP檢測結果顯示，富集的circALG1明顯減少，這說明circALG1與YTHDF1的結合依賴于m6A修飾（圖7E）。進一步研究發現干擾YTHDF1的表達降低了circALG1對miR-342-5p的結合能力（圖7F），并降低了靶基因PGF的表達（圖7G），該作用是通過YTHDF1特異性增強circALG1的穩定性實現的（圖7H）。

作者還從m6A writer的角度研究了circALG1 m6A修飾后ceRNA功能的變化。circALG1 m6A基序為RACH (R = A或G；H = A, C或U)，它可以被METTL3讀取，并催化腺苷酸的甲基化。作者設計了METTL3 siRNA進行相關功能缺失實驗。結果顯示METTL3的沉默降低了circALG1 m6A修飾的水平，削弱了對miR-342-5p的結合能力（圖7I）。雙熒光素酶實驗結果顯示，含有circALG1野生型質粒序列時，沉默METTL3削弱了miR-342-5p對熒光素酶活性的抑制作用，增強了熒光素酶強度。而在circALG1上m6A修飾位點突變的質粒中，METTL3的沉默不影響熒光素酶活性（圖7J）。這些結果說明circALG1 m6A修飾增強其結合miR-342-5p的能力。

圖7 m6A修飾circALG1增強其結合miR-342-5p的能力

圖8 實驗猜想：CircALG1通過競爭性結合miR-342-5p，減輕miR-342-5p對PGF mRNA表達的抑制作用，促進PGF表達，導致CRC侵襲增強

參考文獻：

Lin, C., Ma, M., Zhang, Y. et al. The N6-methyladenosine modification of circALG1 promotes the metastasis of colorectal cancer mediated by the miR-342-5p/PGF signalling pathway. Mol Cancer 21, 80 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01560-6