多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞惡性腫瘤。地塞米松（Dex）是MM治療中使用最廣泛的治療藥物，但患者會(huì)產(chǎn)生Dex耐藥性，從而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展，因此迫切需要研究Dex耐藥的驅(qū)動(dòng)機(jī)制，并開(kāi)發(fā)新的試劑來(lái)解決這一問(wèn)題。目前有研究認(rèn)為SUMO化修飾是調(diào)節(jié)Dex抗性的潛在機(jī)制，而抑制SUMO化修飾可以增強(qiáng)MM對(duì)Dex定的敏感性。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1. 在原發(fā)病人樣本和細(xì)胞系中，抑制SUMOylation增強(qiáng)Dex抗MM的活性

作者前期通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)得到MM漿細(xì)胞中較高的SUMO E1（UBA2）基因表達(dá)與更短的存活時(shí)間相關(guān)。隨后觀察到UBA2表達(dá)水平與Dex IC₅₀s呈顯著正相關(guān)，提示UBA2表達(dá)與MM細(xì)胞Dex耐藥相關(guān)（圖1A）。

用TAK-981（一種新型的選擇性SUMO E1酶小分子抑制劑）處理MM1S細(xì)胞，檢測(cè)SUMOylated蛋白（圖1B）。TAK-981以劑量依賴(lài)的方式抑制整體SUMOylation，并誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志物cleaved PARP。然后，測(cè)試TAK-981單藥和Dex聯(lián)合治療對(duì)MM的影響。在從復(fù)發(fā)骨髓瘤患者分離的原發(fā)MM細(xì)胞中，TAK-981聯(lián)合Dex治療比單藥治療顯著增強(qiáng)了對(duì)MM細(xì)胞的殺傷力 （圖1C）。進(jìn)一步的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAK-981與Dex在MM1S和MM1R細(xì)胞株中均有協(xié)同作用（圖1D）。Dex對(duì)MM1R細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖作用有限。相比之下，TAK-981在兩種細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞活力，與Dex聯(lián)用后效果進(jìn)一步增強(qiáng)（圖1E）。瞬時(shí)敲除SAE2、UBC9可顯著提高MM1R細(xì)胞Dex敏感性（圖1F）。穩(wěn)定敲除SAE2、UBC9的細(xì)胞對(duì)Dex處理均表現(xiàn)出顯著的反應(yīng)，MM1R cells的IC₅₀s值均下降（圖1G）。這些數(shù)據(jù)表明，SUMOylation與Dex抗性有關(guān)，抑制SUMOylation增強(qiáng)了Dex敏感性

圖1在原發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和MM細(xì)胞系中，抑制SUMOylation與Dex協(xié)同降低細(xì)胞活力

2. TAK-981在體內(nèi)顯示出抗MM活性

通過(guò)構(gòu)建小鼠兩種異種移植模型，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，TAK-981治療組小鼠骨髓瘤負(fù)擔(dān)顯著降低（圖2A-B）。另外，與體外實(shí)驗(yàn)一致，Dex單獨(dú)治療不影響腫瘤生長(zhǎng)，而TAK-981與Dex聯(lián)合治療時(shí)，能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步降低腫瘤負(fù)荷（圖3C）。免疫組化染色分析表明Dex單獨(dú)處理幾乎沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而TAK-981處理組明顯誘導(dǎo)cleaved PARP表達(dá)，Dex聯(lián)合處理后cleaved PARP表達(dá)水平更高（圖2D）。結(jié)果表明，TAK-981具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗MM活性。

圖2 TAK 981在體內(nèi)抑制MM腫瘤生長(zhǎng)并與Dex協(xié)同作用

3. 抑制SUMOylation通過(guò)下調(diào)miR-130b上調(diào)GR來(lái)提高Dex的敏感性

有報(bào)道稱(chēng)GR的表達(dá)是Dex反應(yīng)的主要機(jī)制，并與MM患者較好的預(yù)后有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)GR表達(dá)與原代MM細(xì)胞Dex IC₅₀s值呈負(fù)相關(guān) （圖3A）。基于SUMOylation抑制增強(qiáng)了Dex的敏感性，進(jìn)而評(píng)估抑制SUMOylation對(duì)GR表達(dá)的影響：在TAK-981治療48小時(shí)后，劑量依賴(lài)性GR （NR3C1） mRNA上調(diào)（圖3B）。據(jù)報(bào)道，通過(guò)靶向3’-UTR下調(diào)GR mRNA水平的miR-130b，在相同的原代MM細(xì)胞中，經(jīng)TAK-981處理后顯示出劑量依賴(lài)性降低（圖3C）。在TAK-981處理的原代MM細(xì)胞中也誘導(dǎo)了GR蛋白水平（圖3D）。在MM1S和H929細(xì)胞系中觀察到類(lèi)似的GR水平誘導(dǎo)和miR-130b降低（圖3E和F）。TAK-981降低了MM1S和H929細(xì)胞中RRM2水平，并進(jìn)一步協(xié)同降低Dex對(duì)RRM2的降低。相應(yīng)的誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志物cleaved PARP（圖3G），表明TAK-981對(duì)Dex細(xì)胞毒性的增強(qiáng)與GR regulated RRM2的抑制有關(guān)。SAE2水平較低（Sumoylization low）的患者GR抑制基因RRM2表達(dá)較低，GR激活基因RASD1水平較高。該分析支持了表明SUMO化抑制上調(diào)GR途徑。

圖3 TAK-981通過(guò)下調(diào)miR-130b上調(diào)原發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤和細(xì)胞系中GR的表達(dá)

4. 抑制SUMOylation通過(guò)調(diào)控miR-551b和miR-25提高了MM對(duì)Dex的敏感性

miR-mimic轉(zhuǎn)染后，過(guò)表達(dá)miR-551b和miR-25可促進(jìn)MM細(xì)胞增殖并降低MM1S細(xì)胞的Dex敏感性，IC₅₀s增加約4倍（圖4A-B）。miR抑制劑轉(zhuǎn)染miR-551b和miR-25后，miR-551b和miR-25的下調(diào)抑制了MM1R細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)了Dex敏感性，IC₅₀s從875 μM下降到193和142 μM（圖4C-D）。這些數(shù)據(jù)表明，miR-551b和miR-25的表達(dá)可能與MM對(duì)Dex的耐藥有關(guān)。

由于PJA1和ZNF280C在MM細(xì)胞中沒(méi)有大量表達(dá)，因此ZFP36成為miR-551b的唯一潛在靶點(diǎn)。ZFP36編碼的tristtrprolin （TTP）是一種RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)破壞Cyclin D1和E2F1 mRNA的穩(wěn)定性在癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-551b inhibitor下調(diào)miR-551b水平，導(dǎo)致TTP水平升高，Cyclin D1和E2F1水平下降（圖4E）。ZFP36與miR-551b在初次MM樣本中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖4F），進(jìn)一步表明miR-551b調(diào)節(jié)ZFP36的水平。miR-25的下調(diào)顯著提高了ULK1的水平。敲低miR-25導(dǎo)致p27水平升高，這與MM初發(fā)樣本中p27 mRNA水平與miR-25呈負(fù)相關(guān)的觀察結(jié)果一致（圖4G-H）。

圖4 MiR-551b和MiR-25水平對(duì)MM Dex敏感性的影響

       MM1R細(xì)胞的miR-551b和miR-25水平高于MM1S（圖5A）。Dex處理降低了MM1S中這兩種miRs的水平，但對(duì)MM1R沒(méi)有影響，而TAK-981處理降低了MM1S和MM1R細(xì)胞系中這兩種miRs的水平，并在與Dex聯(lián)合時(shí)進(jìn)一步降低（圖5A）。通過(guò)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，SAE2或UBC9的下調(diào)降低了MM1R中miR-551b和miR-25的水平（圖5B）。另外，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，TAK-981治療組miR-551b和miR-25水平降低，并在MM1R異種移植瘤組織中聯(lián)合Dex治療后進(jìn)一步降低（圖5C）。用不同濃度的TAK-981、miR-551b和miR-25處理5個(gè)原始MM樣本，其水平均呈劑量依賴(lài)性顯著降低，表明SUMOylation對(duì)miR-551b和miR-25的調(diào)控并不局限于細(xì)胞系（圖5D）。并且TAKU-981誘導(dǎo)miR-551b靶基因TTP表達(dá)，導(dǎo)致MM1R細(xì)胞Cyclin D1和E2F1降低，誘導(dǎo)miR-25靶基因ULK1和p27的表達(dá)（圖5E）。RNA-seq的GSEA分析顯示，TAKU-981影響細(xì)胞周期、凋亡和自噬基因集（圖5F），提示可能是通過(guò)這些基因靶向microRNAs- miR-551b和miR-25水平來(lái)達(dá)到作用。SAE2水平低的患者（UBA2；UBA2low組）的ZFP36（miR-551b靶基因）和ULK1（miR-25靶基因）水平高于SAE2水平高的患者（UBA2；UBA2high組）（圖5G）。該分析進(jìn)一步支持了SUMOylation調(diào)控miR-551b, miR-25及其靶基因的表達(dá)。

圖5抑制SUMOylation降低miR-551b和miR-25水平

5. 抑制SUMOylation通過(guò)c-Myc降低miR-551b、miR-25和miR-130b的表達(dá)

在MM1S細(xì)胞中，c-Myc誘導(dǎo)的miR-551b、miR-25和miR-130b的pri-miR水平的增加可通過(guò)添加TAK-981處理來(lái)抑制（圖6A）。在MM1S細(xì)胞中siRNA轉(zhuǎn)染c-Myc （siMyc）導(dǎo)致pri-miRs和成熟miR水平顯著降低（圖6B）。在Dex誘導(dǎo)的c-Myc敲低后，pri-miRs和成熟miRs下降（圖6C）。TAK-981處理顯著降低了MM1S和MM1R細(xì)胞中這些miRs啟動(dòng)子區(qū)域c-Myc結(jié)合的占用率（圖6D），證明SUMOylation通過(guò)c-Myc結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)調(diào)節(jié)這些miRs的轉(zhuǎn)錄。Dex在MM1S細(xì)胞中對(duì)c-Myc的結(jié)合略有降低，而在MM1R細(xì)胞中對(duì)c-Myc的結(jié)合無(wú)影響，說(shuō)明這些miRs參與了MM對(duì)Dex的敏感性。通過(guò)觀察15例復(fù)發(fā)患者原發(fā)MM細(xì)胞中c-Myc和SAE2水平與miR-551b、miR-25和miR-130b的表達(dá)之間的顯著正相關(guān)，qPCR進(jìn)一步證實(shí)了miR-551b、miR-25和miR-130b對(duì)MM細(xì)胞c-Myc和SAE2的調(diào)控（圖6E-F）。這些都表明，SUMOylation通過(guò)介導(dǎo)c-Myc調(diào)控miR-551b、miR-25和miR-130b的表達(dá)。

圖6 c-Myc是miR-551b、miR-25和miR-130b的主要轉(zhuǎn)錄因子

6. 抑制SUMOylation降低了c-Myc水平

Dex降低了Dex敏感的MM1S細(xì)胞中的c-Myc蛋白，但對(duì)MM1R細(xì)胞沒(méi)有影響。然而，TAK-981處理顯示MM1S和MM1R細(xì)胞系中的c-Myc蛋白均減少，并且與Dex聯(lián)合使用時(shí)導(dǎo)致進(jìn)一步減少（圖7A）。GSEA顯示TAK-981處理抑制了MM1S和MM1R細(xì)胞中Myc靶基因集，TAK-981和Dex聯(lián)合處理比單獨(dú)處理Dex更能抑制Myc靶基因集（圖7B）。并且TAK-981處理MM1R細(xì)胞后，c-Myc蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性下降（圖7C）。與對(duì)照相比，TAK-981處理后的骨髓瘤細(xì)胞中c-Myc下降更快（圖7D），表明抑制SUMOylation通過(guò)增強(qiáng)c-Myc的降解而下調(diào)了c-Myc。另外，western blot結(jié)果顯示，TAK-981處理后，SUMOylation的c-Myc明顯減少（圖7E）。這些結(jié)果證明了c-Myc可通過(guò)直接SUMOylation進(jìn)行調(diào)控。

圖7 抑制SUMOylation通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性降低了c-Myc蛋白水平

結(jié)論

該研究發(fā)現(xiàn)，SUMOylation抑制通過(guò)增加GR，降低miR-551b和miR-25，提高了MM對(duì)Dex的敏感性。SUMO E1抑制劑TAK-981大大提高了MM細(xì)胞系、原代樣本和小鼠異種移植模型對(duì)Dex的敏感性。TAK-981與Dex聯(lián)用具有明顯的體內(nèi)外協(xié)同抗MM作用。