越來越多的研究表明，circrna (circRNAs)的異常表達廣泛參與惡性腫瘤的發生和發展，包括結直腸癌(CRC)。然而，新型circRNA在CRC中的臨床意義、水平、特征、生物學功能和分子機制仍有待進一步研究。本研究探討CircIL4R在結腸癌發生發展中的作用，于2022年11月發表于《Molecular cancer》，IF=15.302。

本文技術路線： 

1. CircIL4R在CRC細胞中被識別
   識別新的致癌circrna有助于了解CRC進展，作者基于公開可用的GEO數據集(GSE126094)進行了生物信息分析，該數據集包括10對CRC組織和ANTs。分析結果顯示共有59個明顯異常的circrna，其中 23個circrna表達上調，36個circrna表達下調(Fig. 1a)。為了進一步驗證這些在CRC細胞株中的表達模式，作者選擇了14個候選circrna。結果發現，與FHC細胞比較，新circRNA hsa_circ_0038718在HCT116、DLD1、LoVo、SW620、HT29和SW480 CRC細胞中顯著上調；因此，作者將這個circrna作為進一步研究的重點(Fig. 1B)。接下來，基于circBase數據庫的注釋，研究hsa_circ_0038718的結構。序列分析表明，hsa_circ_0038718是由IL4R基因的第3、4外顯子(Chr16: 27，351，506-27，353，580)，長度為227nt；因此，作者在本研究中將其命名為circIL4R(Fig. 1C)。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，circIL4R僅在cDNA中有擴增，在gDNA中無擴增，證實了CRC中circIL4R呈環形(Fig. 1d)。此外，RNase R酶切檢測結果顯示，circIL4R mRNA對RNase具有抗性，而線性IL4R mRNA則對R治療不具有抗性(Fig. 1e)。同樣，放線菌素D RNA穩定性分析表明，circIL4R的半衰期比線性IL4R的半衰期更長(Fig. 1f)。隨后，通過核-細胞質分離和FISH檢測circIL4R的亞細胞定位。結果表明，circIL4R主要定位于CRC細胞的細胞質(Fig. 1g， h)。總之，位于細胞質中的circIL4R在CRC中是一種高度穩定且經常上調的circRNA。

Fig1 CRC細胞中circIL4R的鑒定

2.circIL4R在CRC患者中的表達及其臨床意義

為了確定circIL4R在CRC患者中的臨床意義，作者首先在一個隊列中驗證了circIL4R表達情況。FISH染色和qRT-PCR結果檢測顯示，與ANTs組織相比，CRC組織中circIL4R明顯上調，與GEO數據庫的生物信息學分析結果一致(Fig. 2a-d)。鑒于circrna高度穩定且不易降解，作者進一步探索circIL4R是否可以用作CRC的診斷和預后生物標志物。作者首先在一組50例CRC患者中檢測了circIL4R術前和術后的血清水平。結果顯示，術后標本中血清circIL4R較術前標本減少(Fig. 2e)。接下來，作者在另一組40例CRC患者和40例健康受試者中評估了circIL4R的血清表達，發現CRC患者的血清circIL4R明顯高于健康受試者(Fig. 2f)。ROC曲線顯示表明circIL4R標志物具有良好的CRC診斷價值Fig. 2g)。在此外circIL4R的表達在腫瘤病理分期、T分型、N分型和M分型組中存在差異Fig. 2h-k)。對120例CRC患者生存隨訪資料進行分析。Kaplan-Meier生存曲線顯示circIL4R過表達與預后差呈正相關(Fig. 2l，m)。總之，這些結果提示circIL4R可作為CRC的一種有效的預后標志物和新的治療靶點。

3.     TFAP2C在CRC中通過轉錄調控誘導circIL4R的表達

通過JASPAR數據庫識別IL4R啟動子區域序列的轉錄因子，TFAP2C因其位于IL4R啟動子區域的兩個高親和力響應元件而受到關注，分別命名為TBS1和TBS2(Fig. 3a)。此外，GEPIA數據庫的相關分析顯示TFAP2C與IL4R呈正相關(Fig. 3b)。然后，作者構建了TFAP2C過表達和干擾質粒，通過qRT-PCR和WB驗證TFAP2C在CRC細胞中的相對表達(Fig. 3c， d)。熒光素酶報告基因檢測結果表明，在TFAP2C基因敲除后，?1987/?913片段驅動的熒光素酶活性顯著降低(Fig. 3h)，而在TFAP2C過表達的細胞中增強(Fig. 3i)。然而，?792/429片段的變化對TFAP2C表達的變化及熒光素酶的活性沒有影響(Fig. 3h,i)。這些結果證實了TFAP2C反應位點包含在IL4R啟動子?1987/?913區域。接下來，針對IL4R啟動子的不同區域設計7對引物(P1-7) (Fig. 3j)。ChIP和定量PCR結果顯示TFAP2C與P5-7區域結合。值得注意的是，P5和P6也被稱為IL4R啟動子中的TFAP2C結合位點1 (TBS1)和TBS2(圖3k)。此外，作者在120人的隊列中通過qRT-PCR驗證了TFAP2C的mRNA表達，應用免疫組化法檢測TMAs中TFAP2C蛋白水平。結果顯示，與ANTs相比，TFAP2C在CRC組織中的表達顯著上調，并與circIL4R呈正相關(Fig. 3l-n)。

Fig 3 TFAP2C通過轉錄調控增強circIL4R的表達

4.     CircIL4R在體外促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲
   為了研究circIL4R在CRC細胞中的生物學功能，作者構建了兩個siRNA(si-circIL4R#1和sicircIL4R#)，采用qRT-PCR方法檢測circIL4R在不同CRC細胞系(HCT116、DLD1、LoVo、SW620、HT29、SW480)和正常結直腸上皮細胞株(FHC)中的表達情況。結果顯示，circIL4R在HCT116和DLD1細胞中表達顯著上調，在LoVo細胞中表達相對較低。接下來在HCT116和DLD1細胞來敲除circIL4R，在LoVo細胞中過表達circIL4R，發現對IL – 4R mRNA水平均無影響(Fig. 4a,b)。CCK-8、EdU和集落形成實驗表明，下調circIL4R可顯著抑制CRC細胞的增殖，而過表達circIL4R則相反(Fig. 4c-h）。這些結果清楚地表明，circIL4R促進CRC細胞增殖。采用Transwell和創面愈合試驗檢測circIL4R對CRC細胞轉移的影響。結果顯示，下調circIL4R表達顯著抑制了HCT116和DLD1細胞的遷移和侵襲能力。相反，過表達circIL4R顯著增強了LoVo細胞的這些能力(Fig. 4i-l）。總之，這些結果表明circIL4R在體外促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲。

Fig 4體外circIL4R促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲

5.CircIL4R通過PI3K/AKT信號通路促進CRC細胞的侵襲行為

KEGG分析結果顯示，circIL4R與PI3K-Akt信號通路顯著相關(Fig. 5a)，因此，作者推斷circIL4R通過PI3K / AKT信號通路促進CRC發展。結果發現，在HCT116和HCT116中，下調circIL4R基因的表達，顯著降低了p-AKT及其下游相關基因的表達水平，PI3K和AKT的總蛋白水平似乎穩定(Fig. 5b)。此外，下調circIL4R對HCT116增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用。740YP（PI3K / AKT信號通路的活化劑）的存在明顯減輕了DLD1細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而LY294002（PI3K/AKT信號通路的抑制劑）對過表達circIL4R對LoVo細胞增殖、遷移和侵襲能力的刺激作用明顯減弱(Fig. 5b)。此外，下調circIL4R對HCT116增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用，在740YP作用下過表達circIL4R對LoVo細胞增殖、遷移和侵襲能力的刺激作用明顯減弱(Fig. 5c-j)。綜上所示，circIL4R通過激活PI3K/AKT信號通路促進CRC細胞的增殖、遷移和侵襲。

Fig 5 circIL4R激活PI3K/AKT信號通路

6.     CircIL4R在CRC細胞中充當miR - 761的海綿
   通過數據庫預測到有7個miRNAs (miR-513a-5p， miR-1286， miR-761， miR-3619-5p， miR-214-3p， miR-1184， miR-139-3p)是circIL4R的潛在靶點(Fig. 6a，b)。通過RNA pull-down檢測進一步確認circIL4R的結合位點，并通過qRT -PCR驗證生物素標記的circIL4R探針(Fig. 6c)。結果表明，在HCT116和DLD1細胞系中，miR-761顯著富集(Fig. 6d,e)。為了闡明circIL4R和miR-761之間的相互作用，作者構建了一個包含野生型(WT)或突變型(Mut)序列的熒光素酶報告基因(Fig. 6f)。結果顯示，轉染miR-761模擬物顯著抑制了表達circIL4R的細胞中的熒光素酶活性，而circIL4R Mut報告組細胞表達量無顯著差異(Fig. 6g, h)。然后，作者研究了miR-761在120名CRC患者和CRC細胞系中的表達。qRT-PCR結果顯示，miR-761在CRC組織中顯著下調，且與circIL4R呈負相關(Fig. 6j-l)。此外，miR-761在CRC細胞中表達顯著下調(Fig. 6i)。此外，FISH檢測結果顯示，circIL4R和miR-761在CRC細胞的細胞質中共定位(圖6m)。總之，circIL4R可能在CRC細胞中作為miR-761的海綿。

Fig 6 circIL4R在CRC細胞中作為miR-761的海綿

7. TRIM29是miR - 761的下游靶基因

基于四個數據庫的交叉分析發現了miR-761靶向的64個候選基因(Fig. 7a)。接下來，作者評估了這些候選基因在結腸癌和直腸癌組織中的表達。在miR-761的預測靶基因中，TRIM29成為作者的主要研究重點，因為與正常組織相比，它在CRC樣本中顯著上調(Fig. 7b， c)。GEO數據庫(GSE87211)得到相同的結果(Fig. 7d)。隨后，qRT-PCR檢測和WB結果顯示，轉染miR-761模擬物顯著降低了CRC細胞中TRIM29 mRNA和蛋白水平的表達，而轉染miR-761抑制劑則引起相反的結果(Fig. 7e, f)。為了進一步闡明miR-761和TRIM29之間的相互作用，作者構建了包含WT或Mut TRIM29 3 ' -UTR的熒光素酶報告基因 (Fig 7g). 熒光素酶報告基因實驗表明，轉染miR-761模擬物顯著抑制了表達TRIM29 WT報告基因的細胞的熒光素酶活性，而在表達TRIM29-MUT的細胞中未檢測到顯著差異 (Fig. 7h，i)，表明miR-761通過直接結合到3' -UTR的TRIM29降低TRIM29的表達。臨床相關結果顯示，在120個CRC組織隊列中，TRIM29 mRNA表達顯著上調，并與miR-761水平呈負相關，與circIL4R水平呈正相關(Fig. 7j-m)。總之，這些發現表明TRIM29是miR-761的直接靶點。

Fig 7 TRIM29是miR-761的下游靶點

8. CircIL4R通過miR - 761/TRIM29軸激活PI3K/AKT信號通路促進CRC進展

TRIM29作為miR-761的下游靶點，已被證實為CRC中的癌基因。因此，作者進一步研究circIL4R和TRIM29的功能。首先，CRC細胞中干擾或過表達TRIM29。CCK-8、集落形成、Transwell和創面愈合實驗證實過表達TRIM29促進CRC細胞的增殖、遷移和侵襲，而敲低TRIM29則表現出相反的效果(Fig. 8a-d)。更重要的是，作者觀察到過表達TRIM29可以抑制circIL4R敲除引起的HCT116細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制，而敲除TRIM29可以在很大程度上抑制circIL4R過表達引起的LoVo細胞的惡性進展(Fig. 8a-d)。作者進一步研究了circIL4R是否通過miR-761/TRIM29軸激活PI3K/AKT信號通路。WB檢測結果顯示，在HCT116細胞中，circIL4基因下調導致的p-AKT水平降低可以被TRIM29的過表達逆轉(Fig. 8e)。 相反，過表達circIL4R誘導的p-AKT水平的上調可以通過下調TRIM29來抑制(Fig. 8e)。綜上所述，circIL4R在促進PI3K/AKT信號通路激活和調控CRC惡性進展中的作用在很大程度上依賴于miR-761/TRIM29軸。

已知腫瘤抑制因子PTEN、PP2A和PHLPP1可抑制PI3K/AKT通路的活性。然而抑制或過表達TRIM29均不改變PTEN和PP2A的表達(Fig. 8f)。TRIM29敲低可上調PHLPP1的蛋白表達，過表達TRIM29則相反；對PHLPP1 mRNA水平無顯著影響(Fig. 8f,g)。 WB分析顯示，TRIM29基因敲除可抑制p-AKT水平。si-TRIM29和si-PHLPP1共轉染逆轉了這種效應，反之亦然(Fig. 8h)。作者推測TRIM29也可以過泛素化修飾PHLPP1激活PI3K/AKT途徑通。為了證實這一假設，作者首先用抗TRIM29和抗PHLPP1抗體進行了共免疫沉淀試驗，以檢測TRIM29是否與PHLPP1相互作用。結果驗證了內源性TRIM29和PHLPP1蛋白在HCT116細胞中的相互作用(Fig. 8i)，在過表達TRIM29的HCT116細胞中，PHLPP1的半衰期明顯降低(Fig. 8j)，提示TRIM29可以介導PHLPP1蛋白的降解。此外，TRIM29對PHLPP1的調控可被蛋白酶體抑制劑MG132調控(Fig. 8k)， 這進一步說明其調控可能源于泛素化過程。更重要的是，泛素化實驗顯示，在HCT116細胞中，TRIM29敲除后PHLPP1泛素化減少，而TRIM29過表達則導致相反的效果(Fig. 8l)。總之，這些發現表明circIL4R可能激活PI3K/AKT信號通路通過trim29介導的泛素化和隨后的PHLPP1降解。

Fig 8 circIL4R通過circIL4R/miR-761/TRIM29/PHLPP1軸促進CRC進展

9. CircIL4R在體內促進CRC細胞增殖和轉移

為了進一步驗證circIL4R在體內對CRC細胞增殖的影響，在HCT116和DLD1細胞中穩定轉染circIL4R 敲低(sh-circIL4R)或陰性對照(sh-Ctrl)（Fig. 9a），然后通過慢病毒包裝注入BALB/c裸鼠體內。結果顯示，下調circIL4R顯著抑制了兩種HCT116和DLD1細胞的腫瘤生長(Fig. 9b,c)。此外，與對照組相比，sh- circil4r組腫瘤的體積和重量明顯減少(Fig. 9d,e)。免疫組化染色顯示，下調circIL4R可降低Ki-67、TRIM29和p-AKT的表達水平，提高PHLPP1的表達水平(Fig. 9f)。此外，將熒光素標記的CRC細胞注射到裸小鼠尾靜脈，以確定circIL4R是否能在體內促進CRC細胞的轉移(Fig. 9g)。結果顯示，circIL4R基因敲除顯著降低了小鼠肺部的熒光強度和轉移性結節的數量(Fig. 9h-j)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，與陰性對照組相比，circIL4R敲除組裸鼠的總生存期更長(Fig. 9k,l)。這些結果與體外實驗一致，證實了circIL4R在體內可促進CRC的惡性進展。

Fig 9 circIL4R在體內促進CRC細胞的腫瘤發生和轉移

本研究首次證明circIL4R在CRC細胞、組織和血清中的表達顯著增加，并可作為診斷和預后的生物標志物。此外，TFAP2C通過轉錄調控誘導circIL4R表達，且circIL4R過表達與miR-761競爭性相互作用，增強TRIM29的表達，從而靶向PHLPP1進行泛素介導的降解，激活PI3K/AKT信號通路，促進CRC的進展。

參考文獻：

Jiang, T., et al., CircIL4R activates the PI3K/AKT signaling pathway via the miR-761/TRIM29/PHLPP1 axis and promotes proliferation and metastasis in colorectal cancer. Mol Cancer, 2021. 20(1): p. 167.