細胞衰老是一種以增殖細胞停止、分泌表型、大分子損傷和代謝改變為特征的細胞狀態，可由幾種不同的應激機制觸發。本研究中，作者探討caspase-4非典型炎癥小體對細胞衰老的影響。這篇文章于2021年12月發表于《springer nature》，IF=10.717

本文技術路線：

主要結果：

1．在人二倍體成纖維細胞中，caspase-4識別的細胞質脂多糖誘導了衰老反應

雖然典型的炎癥小體可以被微生物來源的胞壁酰二肽(MDP) 激活，但半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase-4和caspase-5作為非典型炎癥小體能識別微生物脂多糖（LPS）誘導Gasdermin-D裂解和焦亡。Gasdermin-D是非典型炎癥小體的功能底物，可誘導IL-1β分泌和細胞凋亡。為了比較激活典型和非典型炎癥小體在衰老中的作用，作者在人IMR90成纖維細胞中通過轉染MDP或LPS激活caspase-1或caspase-4/5炎癥小體。為了研究caspase對LPS轉染后的衰老表型的影響，作者在轉染前用shRNA下調caspase-1或caspase-4的表達(圖1A)。結果發現，與caspase-1相比，caspase-4在獲得衰老特征方面是必需的，能增加SA-β-半乳糖苷酶活性增加，減低細胞增殖速度，并且能在存活細胞亞群和死亡細胞中誘導p21CIP1和p16INK4a(圖1B-D)。此外，在存在LPS的條件下，caspase-4過表達加速了衰老(Fig. 1E, F)。說明CASPASE-4的表達對非典型炎癥小體誘導的衰老至關重要，細胞內LPS暴露后的衰老表型的獲得是通過caspase-4介導的，且呈劑量依賴性。

接下來，作者研究caspase-4的底物gasdermin-D和關鍵的衰老調節因子p53在LPS誘導的衰老和焦亡中的作用。GSDMD是炎性caspase的共同底物，P53的敲低（TP53）和GSDMD的敲低顯著降低了LPS依賴的細胞生長停滯 (圖1H, I, J)。有趣的是，在LPS誘導的衰老中，GSDMD的抑制也對p16INK4a和CASPASE-4誘導有強烈的影響?？傊?，這些結果表明，非典型炎癥小體的細胞質LPS感應誘導了一種依賴于caspase-4、gasdermin-D和p53表達的衰老反應。

Fig1 LPS介導的caspase-4活化誘導人原代成纖維細胞衰老表型

2. Caspase-4介導的LPS誘導的衰老反應與IL-1β啟動無關

炎癥小體的激活受到兩種機制的嚴格調控。首先需要提高IL1B的轉錄水平，之后是第二個誘導炎性小體組裝的信號。有趣的是，IMR90成纖維細胞中唯一過表達CASPASE-4或CASPASE-1的衰老誘導并沒有誘導IL1B的轉錄激活(Fig. 2A)。相反，IL1B轉錄水平在LPS轉染后以CASPASE-4依賴的方式增加(Fig. 2B)。

作者之前已經證明TLR2在細胞衰老中控制IL1B表達和衰老相關的分泌表型SASP的作用。因此，作者決定研究TLR2介導的炎性小體啟動是否與LPS介導的CASPASE-4誘導的衰老協同作用。結果發現，合成脂肽Pam2CSK4和Pam3CSK4(分別為LR2/6和TLR 2 /2激動劑) 的加入，而非LPS (TLR4激動劑)和MDP高度誘導了IL1B mRNA。然后，作者觀察到用TLR2受體激動劑Pam2CKS4啟動炎癥小體與LPS轉染顯著協同產生IL-1β誘導，而CASPASE-4異位過表達進一步增強了這種誘導(Fig. 2C)。然而，添加Pam2CKS4，LPS誘導的衰老中，作者沒有觀察到細胞增殖或SA-β-半乳糖苷酶活性顯著下降(Fig. 2D, E)。通過觀察對數增長，在所有條件下，LPS轉染細胞中觀察到的IL1B mRNA水平的增加都是最小的Fig. 2C)。這些結果表明，CASPASE-4刺激的附加信號，如持續啟動信號對IL1B和SASP在LPS介導的細胞衰老中的誘導。此外，這些數據也表明LPS誘導的caspase-4衰老反應是獨立于IL1B和SASP的。

Fig2 LPS介導的caspase-4誘導的衰老與炎性小體啟動無關

3. Caspase-4蛋白水解活性對LPS誘導的衰老不是必需的

Caspase-4的活性位點已經被鑒定為與殘基C258相關，該氨基酸的點突變使該蛋白催化失活。為了進一步研究Caspase-4蛋白酶的酶活對衰老的影響，作者在IMR90細胞中過表達CASPASE-4野生型和催化死亡的突變體C258A (CASPASE-4C258A) (Fig. 3A), 并對表型結果進行評估。過表達野生型caspase-4或caspase-4C258A可使細胞增殖降低，SA-β-半乳糖苷酶活性增加(Fig. 3B, C)。接下來，在LPS轉染前，在IMR90成纖維細胞中穩定過表達野生型caspase-4和caspase-4C258A (Fig. 3D)。結果發現過表達caspase-4C258A而非野生型caspase-4的 IMR90細胞對LPS轉染后的細胞死亡具有耐藥性(Fig. 3E)。表明CASPASE-4野缺陷形式在焦亡中具有負作用。然而，CASPASE-4野生型和CASPASE-4C258A過表達的細胞在LPS刺激后仍然對衰老特征敏感(Fig. 3F, G)。這些結果表明，與caspase-4介導的細胞焦亡相反，caspase-4在在脂多糖誘導的衰老與caspase-4催化活性無關。

Fig 3 Caspase-4介導的衰老調控獨立于其催化功能

4.Caspase-4在癌基因誘導的衰老過程中被誘導和組裝

接下來，作者研究了caspases在癌基因誘導衰老中(OIS)的作用。為誘導OIS，在IMR90人成纖維細胞中過表達RASG12V。HRASG12V過表達降低細胞增殖，增加SA-β-半乳糖苷酶活性(Fig. 4A)。與細胞周期抑制劑p21CIP1、p16INK4a和p15INK4b的上調相一致，RASG12V過表達后，Caspase-4在mRNA和蛋白水平上的表達均增加(Fig. 4B, C)。接下來，作者利用誘導系統來嚴格控制衰老進程。在這個系統中，雌激素受體(ER)配體結合域的突變體與感興趣蛋白(RAS)融合;結果發現ER:RAS細胞在添加4-羥他莫西芬(4OHT)后發生致癌基因誘導衰老(Fig. 4D)。與未處理的IMR90 ER:RAS相比，加入4OHT后，IMR90 ER:RAS細胞出現細胞增殖停滯，SA-β-半乳糖苷酶活性增加(Fig. 4D)。在OIS處理的細胞中，caspase-4 mRNA水平、IL1B mRNA水平、以及Caspase-4蛋白表達呈指數增長 (Fig. 4E, F,G)。此外，內源性caspase-4寡聚化在IMR90 ER:RAS衰老細胞中檢測到，但在4OHT處理后3天的對照組細胞中未檢測到(Fig. 4H)。此外，加入4OHT之后的第4天和第8天，IMR90 ER:RAS細胞中caspase-4蛋白水解活性也有所提高(Fig. 4I)。這些結果表明，在OIS中，caspase-4的表達被誘導，非典型炎癥小體被組裝。

圖4 Caspase-4非典型炎癥小體在癌基因誘導的衰老中被激活

5.在OIS中，Caspase-4非典型炎癥小體是炎癥信號轉導所必需的

接下來，作者用IMR90 ER: RAS系統研究了caspase-4在OIS中的功能作用，分析CASPASE-4缺失后mRNA表達的整體變化。IMR90 ER:stop和ER: RAS 細胞轉染CASPASE-4和CASPASE-4 干擾序列，5天后和8天后采集樣本，在caspase-4激活和SASP完全形成后立即加入4OHT，并進行轉錄組分析(Fig. 5A)。轉錄組測序分析發現有557個和478個基因顯著差異表達，RASG12V-OIS 細胞中添加OHT添加的第5天和第8天分別有340個和240個CASPASE-4依賴方式誘導的基因(Fig. 5A)。對50個標志性基因的轉錄組數據進行基因集富集分析(GSEA)，結果顯示RASG12V-OIS細胞CASPASE-4依賴調控與炎癥過程相關，包括TNF-α信號和干擾素反應。熱圖顯示，如果靶向CASP4(包括SASP因子)，那么衰老過程中炎癥相關基因的增加表達會被消除(Fig. 5C-E)。血清淀粉樣蛋白SAA1和SAA2屬于載脂蛋白家族，能激活先天和適應性免疫細胞，最近被確認為SASP因子。作者發現當CASPASE-4成為OIS的靶點時，SAA1和SAA2的表達也降低了(Fig. 5F, G)。此外，當CASPASE-1或CASPASE-4被靶向時，細胞內成熟IL-1β的水平也顯著降低(Fig. 5H, I, J)。在RASG12V誘導的細胞中，當CASPASE-4靶向時，分泌的IL-1β濃度顯著降低(Fig. 5K)。此外，通過抑制CASPASE-4的表達，OIS中IL1B、IL6和IL8 mRNA的誘導也受到了影響 (Fig. 5L)。這些結果表明caspase-4參與了caspase-1介導的OIS中SASP的激活。

Fig 5 Caspase-4激活控制促炎SASP

6.在OIS中，caspase-4非典型炎癥小體有助于抑制細胞增殖

為了研究非典型炎癥小體在OIS中調節細胞增殖中的作用，作者對 CASPASE-4進行干擾。結果發現caspase-4靶向siRNA轉染顯著挽救了OIS期間的早期細胞增殖停滯(Fig. 6A)，增加了總細胞含量(Fig. 6B, C)。事實上，靶向CASPASE-4降低了p16INK4a的表達，挽救了pRb的磷酸化(Fig. 6E)，并導致E2F靶基因水平的轉錄增加(Fig. 6E), 這表明在OIS中CASPASE-4是通過控制p16INK4a和p15INK4b的表達來調節細胞增殖。總之，CASPASE-有助于阻止細胞衰老過程中的增殖，最終影響pRb的磷酸化狀態，從而導致E2F靶基因的轉錄抑制。

Fig6 在OIS中，Caspase-4有助于抑制細胞增殖

7.在體內， Caspase-11細胞衰老過程中被誘導

作者已經證明caspase-4表達水平在細胞衰老中尤為關鍵。為了研究非典型炎癥小體在體內衰老中的表達，作者使用了三種特征良好的小鼠衰老模型。作者首先在一個OIS模型中分析了caspase-4小鼠同源caspase-11的表達，該模型由Pdx-CRE誘導表達小鼠胰腺胰上皮內瘤變(PanIN) (Fig. 7A)。作者觀察到與周圍胰腺腺泡細胞、高級別、野生型小鼠導管和腺泡細胞相比，低檔PanINs顯示caspase-11染色陽性(Fig. 7A)。重要的是，PanINs中Ki-67染色定量顯示，caspase-11的表達局限于早期增生指數低的衰老病灶(Fig. 7B)，這表明caspase-11的表達與PanIN病變的低級別細胞增殖低相關。然后，作者研究了caspase-11在兩種與體內衰老相關的細胞衰老模型中的表達。首先，作者通過敲除NF-κ b調控因子nfkb1-/- (p50-/-)，構建NF-κ b結構激活的加速衰老的小鼠模型，該模型顯示了包括肺在內的不同組織的衰老。在這個模型中，脂褐素積累已被證明與衰老有關，并且與野生型小鼠相比，nfkb1-/-在肺中脂褐素積累增加(Fig. 7C)。在caspase-11表達的細胞中也檢測到脂褐素積累的類似增加(Fig. 7C)。此外，作者還發現了在野生型和nfkb1-/-小鼠中小氣道上皮細胞中p21和caspase-11的相關性，發現caspase-11與小鼠加速衰老模型中的衰老標記物相關(Fig.7D)。

然后，作者研究了caspase-11在小鼠自然機體衰老過程中肺泡細胞衰老中的表達，發現老年小鼠(24月齡)肺泡細胞數量端粒相關DNA損傷反應(DDR)病灶(TAFs)增加(Fig.7E), 這是組織中衰老細胞積累的標志，作者發現這與caspase-11的增加同時發生(Fig.7F)。總之，這些結果驗證了非典型炎癥小體促進體內衰老的模型。

Fig7 Caspase-11在體內衰老過程中被誘導表達

本研究中，作者表明細胞衰老是由非典型炎癥小體的胞質LPS識別誘導的，并且這一途徑在細胞對致癌應激的反應中是保守的。

參考文獻：

Fernández-Duran I, Quintanilla A, Tarrats N, Birch J, Hari P, Millar FR, Lagnado AB, Smer-Barreto V, Muir M, Brunton VG, Passos JF, Acosta JC. Cytoplasmic innate immune sensing by the caspase-4 non-canonical inflammasome promotes cellular senescence. Cell Death Differ. 2021 Dec 16. doi: 10.1038/s41418-021-00917-6. Epub ahead of print. PMID: 34916628.