骨肉瘤是一種高度侵襲性的癌癥，常見于兒童和青少年。對于轉移性或復發性骨肉瘤仍然缺乏有效的治療方法。本研究報道了一種新的lncRNA在骨肉瘤轉移中的關鍵作用，其有作為靶向治療的潛在靶點。本文發表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》IF：8.886的2021年12月刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上調，并與骨肉瘤的遠處轉移有關

如圖1所示，作者分析TARGET數據庫骨肉瘤的轉錄組數據，鑒定了轉移組織和非轉移腫瘤組織的差異表達lncRNA，此外，MELTF-AS1的表達，與正常組織相比，在腫瘤中高表達；與非轉移的腫瘤組織相比，在遠端轉移組織中高表達；MELTF-AS1高表達和不良預后相關；它同時在多個骨肉瘤細胞系中高表達，但是在尤文氏肉瘤細胞系中卻沒有高表達，表明其特異性。

圖1 lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上調并與骨肉瘤的遠處轉移有關

2、RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉錄

隨后作者為何MELTF-AS1的表達在骨肉瘤中升高。使用JASPAR數據庫預測了可能與MELTF-AS1啟動子結合的轉錄因子，其中RREB1的預測得分最高，而沉默RREB1之后，MELTF-AS1的表達顯著減少，過表達則相反（圖2A-B）。此外，RREB1的表達在遠端轉移組織中最高，其次是未轉移腫瘤，最后是正常組織，免疫組化可以清晰展示這一點（圖2C-D）。RREB1抗體的染色質免疫沉淀(ChIP)實驗表明，它可以直接結合MELTF-AS1的啟動子區域（圖2E）。熒光素酶報告基因實驗表明，當RREB1過表達是，熒光素酶活性顯著增加，但是當RREB1和啟動子結合區域敲除后，過表達RREB1也不能改變熒光素酶活性（圖2F）。這些表明RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉錄。

圖2 RREB1結合MELTF-AS1的啟動子激活其轉錄

3、MELTF-AS1促進骨肉瘤的體內外轉移

如圖3所示，干擾MELTF-AS1的表達，抑制骨肉瘤細胞的體外轉移和體內腫瘤的轉移，表現為轉移結節減少，轉移標志物表達下降，且敲除MELTF-AS1后小鼠的總體生存率顯著提高。這些結果表明MELTF-AS1可促進骨肉瘤的體內外轉移。

圖3 敲除MELTF-AS1抑制骨肉瘤的體內外轉移

4、MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA機制調控miR-485-5p

FISH和亞細胞分離的qRT-PCR分析結果顯示MELTF-AS1主要定位在細胞質中（圖4A-B），因此，推測其可能作為ceRNA發揮功能，預測了可能具有潛在結合關系的miRNA并進行生物素標記MELTF-AS1探針的RNA pull-down實驗。結果如圖4C所示，miR-485-5p和miR-665可以與MELTF-AS1直接結合，但因為前者的結合豐度更高，所以選擇miR-485-5p進行實驗。如預期地，沉默MELTF-AS1后miR-485-5p的表達顯著升高，過表達則相反（圖4D-E），RNA IP結果顯示MELTF-AS1和miR-485-5p都可以和AGO2蛋白直接結合，并且熒光素酶實驗的結果也表明兩者具有直接結合關系（圖4F-G）。此外，miR-485-5p在骨肉瘤組織中的表達與MELTF-AS1完全相反，和正常組織相比，在非轉移性腫瘤組織中下調表達，在遠端轉移的組織中進一步顯著下調表達。以上結果表明MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA機制調控miR-485-5p。

圖4 miR-485-5p是MELTF-AS1的一個靶點

5、MELTF-AS1通過與miR-485-5p的相互作用調控MMP14的表達

通過生物信息學分析發現轉移相關蛋白MMP14是miR-485-5p的一個靶基因，熒光素酶實驗證實兩者間具有直接結合關系（圖5A）。而沉默MELTF-AS1會顯著下調MMP14的表達，而當MELTF-AS1沉默和miR-485-5p的抑制劑共同作用時MMP14的表達回復到接近正常水平（圖5B）。此外，過表達MELTF-AS1會導致MMP14的表達升高，但是與miR-485-5p同時過表達，則MMP14表達升高的趨勢被抑制（圖5C-D）。進一步分析發現MMP14的表達和MELTF-AS1的表達正相關，和miR-485-5p的表達負相關。總之，MELTF-AS1吸附細胞質中miR-485-5p的表達，以ceRNA機制促進MMP14表達。

圖5 MELTF-AS1通過與miR-485-5p的相互作用調控MMP14的表達

6、MELTF-AS1通過調節MMP14促進骨肉瘤轉移

如圖6所示，過表達MELTF-AS1增加了骨肉瘤細胞的轉移和遷徙，和轉移標志物分子的表達，但是在過表達MELTF-AS1的同時，過表達miR-485-5p或者抑制MMP14的表達，則顯著減少了這種轉移能力的能加。表明MELTF-AS1是通過調節MMP14促進骨肉瘤轉移。

圖6 MELTF-AS1表現出部分依賴于MMP14的促轉移特性

總之，如圖7所示，轉錄因子RREB1激活MELTF-AS1的轉錄，其海綿吸附miR-485-5p進而上調靶基因MMP14的表達，導致骨肉瘤細胞轉移能力的獲得。

圖7 本研究的機制模型圖

參考文獻：

Ding Lei., Liu Taiyuan., Qu Yuan., Kang Zhichen., Guo Lixin., Zhang Haina., Jiang Junjie., Qu Fuling., Ge Wanbao., Zhang Shanyong.(2021). lncRNA MELTF-AS1 facilitates osteosarcoma metastasis by modulating MMP14 expression. Mol Ther Nucleic Acids, 26(undefined), 787-797. doi:10.1016/j.omtn.2021.08.022