細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種最新發現的細胞程序性死亡方式。主要通過炎癥小體介導包含Caspase-1在內的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內的多種Gasdermin家族成員發生剪切和多聚化，造成細胞穿孔，進而引起細胞死亡。相比于細胞凋亡，細胞焦亡發生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放，在形態學上同時具有壞死和凋亡的特征。近年來在國自然基金中標項目中細胞焦亡相關項目日益增多，且增長趨勢明顯。

乳腺癌 (BrCa) 是最常見的癌癥，也是女性癌癥相關死亡的第二大原因。隨著乳腺篩查的發展，5年相對生存率有所提高，但復發和轉移性BrCa的治療仍然是一個巨大的挑戰。今天我們講一篇關于乳腺癌焦亡的文章，該文章題名為Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer，2021年3月5日發表于Theranostics期刊。

DRD2通過 BrCa 中的啟動子甲基化被轉錄下調

為了研究新的潛在腫瘤抑制基因 (TSG)，使用BrCa組織和正常組織進行 測序篩選。發現與正常乳腺組織相比，BrCa組織中DRD2的mRNA表達顯著下調。通過IHC染色，與BrCa組織相比，在正常乳腺組織中也發現了更高的DRD2蛋白水平。TCGA數據顯示，在BrCa中DRD2 mRNA的下調，并且DRD2的啟動子甲基化在BrCa中也更頻繁。在另一個數據庫MethHC上進一步分析了表達和啟動子甲基化狀態。與DRD3和DRD4不同，發現DRD2伴隨啟動子的高甲基化狀態被下調。基于TCGA數據庫分析BrCa患者DRD2表達與病理特征的關系。DRD2的高表達與患者年齡呈負相關。此外，在HER2 陰性患者中DRD2表達較高。還分析了DRD2啟動子甲基化與病理特征之間的關系。結果表明，DRD2甲基化增加在老年人群中更為常見。基于Kmplot，DRD2 的更高表達促進了BrCa患者的更長生存期，這在HER2陽性基因型患者中也可見。但是這種優勢在患者中沒有看到。根據RT-PCR和MSP結果，與永生化的正常乳腺細胞系相比，幾乎所有BrCa細胞系中都可以看到DRD2 mRNA表達的下調以及的啟動子甲基化。因此，DRD的高甲基化頻率可能有助于其下調BrCa。用 Aza進行藥理去甲基化恢復了兩個BrCa細胞系MDA-MB231和BT549中DRD2的表達。DRD2 是一種潛在的 TSG，也是預測 BrCa 患者預后的有希望的生物標志物。

DRD2 作為 TSG 起作用并抑制上皮間質轉化 (EMT)

構建穩定過表達DRD2的MDA-MB231和BT549細胞并通過RT-PCR和WB驗證。DRD2的過表達抑制了腫瘤細胞的生長，如CCK8 測定所證明的。并且DRD2也損害了生存能力，如克隆形成試驗所示和軟瓊脂形成試驗。DRD2表達顯著促進BrCa細胞凋亡并在G2/M階段阻斷MDA-MB231和BT549。此外，DRD2的過表達促進了BrCa細胞對PTX的敏感性。在劃痕試驗中，DRD2 的異位表達表現出比對照組更小遷移能力。DRD2的過表達顯著降低了BrCa遷移和侵襲。在體內進一步確定了DRD2的腫瘤抑制作用。皮下腫瘤模型表明源自 DRD2 過表達模型的腫瘤體積和重量均減少。

EMT在癌細胞的遷移和侵襲中很重要。在DRD2過表達后，MDA-MB231 和 BT549 的形態變為上皮樣類型。WB結果表明 E-鈣粘蛋白的表達增加，波形蛋白以及另一種前 EMT 轉錄因子 ZEB1 的表達降低。IF染色還表明DRD2的異位表達誘導MDA-MB231失去間充質標志物波形蛋白并獲得上皮標志物E-鈣粘蛋白。總之，DRD2 能夠在體外和體內抑制腫瘤發生，并且 DRD2 還抑制 BrCa 細胞的 EMT。

DRD2 轉染的 BrCa 促進巨噬細胞M1 表型

據報道，DRD2以前調節巨噬細胞M的極化。在這項研究中，來自BrCa患者的IHC結果表明，在具有較高 DRD2 表達的 BrCa 組織中，M1巨噬細胞的浸潤增加，M2巨噬細胞的濾過減少。為了進一步研究DRD2在調節TAM中的功能，構建了BrCa和巨噬細胞的共培養系統。當巨噬細胞與表達 DRD2的BrCa 細胞共培養時，如qRT-PCR所示，M1 表型的標志物增加，而M2巨噬細胞 標志物下調。qRT-PCR 還證實載體轉染的BrCa細胞將巨噬細胞調節為M2型。WB結果確定M1標志物iNOS被過表達DRD2的BrCa細胞上調，而M2標志物CD206 被下調。IF染色顯示巨噬細胞在與表達DRD2的腫瘤細胞共培養后表現出M1表型。上述結果表明BrCa中的DRD2具有將巨噬細胞重編程為M1表型的能力。

為了探索將巨噬細胞極化為M1表型的關鍵調節因子，進行了細胞因子陣列分析。結果表明，誘導M1極化的兩種經典細胞因子TNFα和IFN γ沒有增加。然而，與巨噬細胞共培養后，DRD2 顯著下調IL-6和IL-10。進一步證實IL-6和IL-10的下調。因此，DRD2可以將巨噬細胞重新編程 M1表型，并在串擾期間顯著下調IL-6和IL-10。

DRD2 重編程的巨噬細胞誘導腫瘤細胞的焦亡

來自小鼠模型的攜帶 DRD2 的腫瘤表現出增加的腫瘤細胞死亡，如 HE 所示。在IHC染色中，表達 DRD2 的腫瘤樣本顯示更高的 pMLKL 表達。根據 TUNEL 測定，DRD2 還促進了體內細胞凋亡。GSDM而不是GSDMD被DRD2 上調。巨噬細胞在串擾過程中進一步促進了DRD2轉染的BrCa細胞GSDME的表達。在表達DRD2的BrCa細胞中，IL-1β 也被巨噬細胞上調。WB 結果所表明，DRD2誘導MLKL的磷酸化，在共培養過程中被巨噬細胞抑制。此外，DRD2 表達激活了caspase-8。假設，DRD2 可能在與巨噬細胞的串擾期間誘導細胞焦亡。當在BrCa細胞中與巨噬細胞共培養時，NLRP3的組裝在表達DRD2的BrCa 細胞中被觸發。IL-1β和IL-18的成熟也被激活的caspase-1蛋白水解誘導。Cleaved caspase-3在共培養過程中被上調。切割的caspase-3可以切割GSDME的N端。此外，在共培養過程中，發現GSDME的N端在BrCa細胞中被切割并表達DRD2。為了確定細胞焦亡是否由M巨噬細胞觸發，使用LPS誘導的M1巨噬細胞培養基，結果表明巨噬細胞僅觸發NLRP3組裝并切割具有DRD2表達的BrCa細胞中的GSDME。上述結果表明 DRD2 可以誘導程序性細胞死亡 (PCD)，包括細胞凋亡和壞死性凋亡，并且這些事件被巨噬細胞轉換為細胞焦亡。并且M1巨噬細胞以 DRD2依賴性方式觸發 BrCa 細胞的焦亡。

DRD2 通過中斷 TAK1 的磷酸化來限制 NF-κB 信號激活

NF-κB信號的激活對于觸發炎性體組裝和隨后的細胞焦亡至關重要。探索DRD2對NF-κB活化的影響。IF染色表明DRD2幾乎阻斷p-p65的核轉位，但是這種抑制被巨噬細胞抵消了。細胞核和細胞質的提取物也表明DRD2抑制p-p65的核易位。如WB結果所示，DRD2通過LPS刺激抑制了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化。異位DRD2表達也顯著抑制了巨噬細胞誘導的p65磷酸化和 IKKα/β的上游激活。WB結果顯示 DRD2下調 ICAM-1，NF-κB 的下游靶標。然而，這種下調被巨噬細胞抵消。IKKα/β磷酸化的抑制表明DRD2負介導IKK 復合物的上游。TAK1在催化IKKα和IKKβ中起著關鍵作用。TAK1的磷酸化被異位DRD2表達顯著抑制。一般而言，DRD2 通過中斷其上游激酶 TAK1 來抑制NF-κB信號激活。

作為典型的G蛋白偶聯受體，DRD2的內在化誘導質膜招募其適配器β-arrestin2的的并且增加了其親和力結合β-arrestin2的。LPS和CM刺激了DRD2和β-arrestin2的蛋白-蛋白結合。IF染色DRD2似乎與LPS處理的細胞質中的p-p65結合，并且結合被Co-IP和IB進一步證實。本研究還證實內化的DRD2可以促進TAB1與β-arrestin2的結合，并削弱TAB1與TAK1的結合最重要的是，DRD2 激活的 β-arrestin2 通過與TAB1 競爭性結合來拮抗TAK1的磷酸化。

DRD2通過下調DDX5和eEF1A2抑制NF-κB通路激活和腫瘤發生

異位 DRD2表達顯著抑制p65和 NF-κB 靶基因IL-10的mRNA表達，表明在沒有配體激活的情況下，DRD2是NF-κB通路的負調節因子。除了結合激活 β-arrestin2，DRD2 還可能以其他方式抑制 NF-κB 信號。為了研究機制，通過 Co-IP 結合MS分析來鑒定結合蛋白質。在MDA-MB231和BT549細胞的所有結合蛋白中，DDX5、eEF1A2和ICAM-1都被證實被異位DRD2表達下調。DDX5和EEF1A2有幾種癌癥型號的癌基因。WB也證實了DDX5和eEF1A2 的下調蛋白水平。在293T和MDA-MB231中，通過 Co-IP 和 IB 測定證實了DRD2、DDX5和eEF1A2 的結合，表明這三種蛋白質形成了復合物。還揭示了293T和 MDA-MB231中 DDX5和p50之間的結合。此外，據報道，DRD2 與神經系統中的 EGFR 結合。在BrCa細胞中，DRD2和EGFR的結合也在293T和MDA-MB231中得到證實。并且DRD2表達下調ERBB1（EGFR）和ERBB2（HER2）表達，它們也是 NF-κB 的靶基因。而在DRD2過表達的BrCa細胞中，發現 DDX5促進 IκBα和p65的磷酸化。eEF1A2被證明可以直接強烈增加p-p65而不影響IKKα/β或IκBα，并且 eEF1A2在表達 DRD2 的 MDA-MB231 中甚至在沒有 LPS 的情況下上調p-p65 的蛋白質水平。上述結果表明，DRD2過表達抑制了 DDX5 和 eEF1A2 對促進 NF-κB 信號激活影響顯著。上述結果進一步證實 DRD2 抑制 NF-κB 信號激活并通過下調 BrCa 細胞中的 DDX5 和 eEF1A2 發揮腫瘤抑制作用。