骨關節炎（OA）是一種慢性退行性關節疾病，最常見于老年人，是世界范圍內致殘的主要原因。大量的危險因素已被證明與骨關節炎的進展有關，包括衰老、性別、肥胖、遺傳、關節松弛、肌肉無力和既往的關節損傷。盡管骨關節炎對經濟和社會的影響越來越大，但對其發病機理的深入了解仍然是難以捉摸的。以往研究表明，circRNA 和miRNA在炎癥緩和中具有重要作用，可能是治療骨關節炎的新型研究靶點。近期，浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院趙興博士的團隊發現miR-125a-5p下調Smad2的表達，誘導TGF-β信號通路障礙，而CircCDK14能夠作為miR-125a-5p的海綿促進Smad2的表達緩和骨關節炎，相關研究結果以“CircCDK14 protects against Osteoarthritis by sponging miR-125a-5p and promoting the expression of Smad2”為題發表在Theranostics雜志上，雜志影響因子8.579。
研究思路：
1.根據測序結果篩選在骨關節炎組織中表達下調的circRNA（CircCDK14），并在軟骨細胞中進行表征；
2.探討所選CircCDK14在軟骨細胞細胞外基質（ECM）代謝、細胞增殖和細胞凋亡中的作用；
3.研究CircCDK14的ceRNA機制，以及相關靶點在骨關節炎中的作用；
4.探討CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2在兔模型中的作用。
結果：
1.CircCDK14在骨關節炎中的表達特征
    作者通過之前的測序結果發現CircCDK14在骨關節炎組織中顯著下調（A），進一步研究發現15個人類軟骨樣本中CircCDK14在關節承重區域顯著下調（B-D）。通過體外培養骨關節炎人群的軟骨細胞，并添加IL-1β、LPS 或TNF-α模擬骨關節炎微環境，發現在添加IL-1β、LPS 或TNF-α后CircCDK14表達大幅度減少（E）。作者利用Sanger測序確定了CircCDK14是頭到尾剪接（F），并利用引物確定CircCDK14的環狀結構（G），且RNA酶 R處理后因其共價閉環結構不被降解（H）。熒光原位雜交發現CircCDK14主要定位于細胞質。以上結果說明CircCDK14主要表達于細胞質中，在關節承重區域顯著性低表達。

2.CircCDK14在軟骨細胞細胞外基質（ECM）代謝、細胞增殖和細胞凋亡中的作用
    作者通過siRNA沉默軟骨細胞中CircCDK14的表達，并利用WB、qRT-PCR、IF實驗發現CircCDK14沉默能后促進MMP3和MMP13的表達，抑制Sox9和Collagen II的表達（A-D），且能減弱人類軟骨細胞增殖（F）。流式細胞術分析發現CircCDK14沉默顯著增加了細胞凋亡的比率（E）。

    通過WB、qRT-PCR、IF實驗發現過表達CircCDK14能夠抵消用IF-1β處理對促進MMP3和MMP13表達以及抑制Sox9和Collagen II表達的影響（A-D），且能使IL-1β處理后降低的增殖能力顯著增強（E）。以上結果說明CircCDK14通過調節軟骨細胞的增殖、凋亡和ECM代謝預防骨關節炎。

3. 人類軟骨細胞中CircCDK14與miR-125a-5p的作用機制
    作者通過qRT- PCR發現與對照組相比，Ago2過表達組中被Ago2抗體拉下的內源性CircCDK14顯著富集（A）。利用targetscan和rnahybrid預測可能的靶點miRNAs，其中12個miRNAs被重復篩選（B），pull-down實驗發現miR-3137、miR- 1184、miR-125a-5p和miR-3074-5p被拉下來，熒光素酶檢測結果顯示只有miRNA-125a-5p降低了50%以上的熒光素酶活性（E），進一步研究發現miRNA-125a-5p過表達誘導Collagen II和Sox9表達下降，而MMP3和MMP13的表達沒有改變（F）。通過構建熒光素酶報告系統，發現miR-125a-5p和CircCDK14能夠結合（G，H），FISH結果表明miR-125a-5p主要分布在細胞質中（I）。這些結果證實了CircCDK14作為miR-125a-5p海綿發揮作用。

4. miR-125a-5p在骨關節炎中的作用
    作者通過FISH實驗發現miR-125a-5p在關節承重區域顯著性高表達（A），WB、qRT-PCR和IF表明miR-125a-5p過表達能夠下調Collagen II和Sox9（B-C），細胞增殖實驗表明miR-125a-5p的表達水平與細胞增殖能力呈負相關（D）。進一步研究發現miR-125a-5p抑制逆轉了CircCDK14沉默對人類軟骨細胞 ECM合成、細胞增殖和細胞凋亡的影響（E-H）。這些結果表明，miR-125a-5p是CircCDK14的重要下游靶點，同時在軟骨細胞中發揮拮抗CircCDK14的作用。

5. CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2軸
    通過Targetscan、Starbase、miRTarBase和MiRwalk預測軟件篩選了12個可能的mRNA靶點（A），qRT-PCR結果顯示DHX33、Smad2 和ATXN7L3在CircCDK14被下調后表達下調（B），其中只有Smad2對Sox9 和Collagen II有影響（C），且熒光素酶報告實驗表明Smad2與miR-125a-5p能夠結合(D-E)。WB和qRT-PCR實驗結果表明CircCDK14沉默和miR-125a-5p過表達減弱了Smad2的表達，但miR-125a-5p抑制能夠消除CircCDK14沉默誘導的影響（F-I）。以上結果說明Smad2是一個重要的下游靶點。

    作者發現Smad2在15名人類骨關節炎樣本的關節承重區域明顯低表達（A，B），利用siRNA下調Smad2的表達并通過WB、qRT-PCR和IF實驗發現Smad2沉默顯著性降低了軟骨細胞中Sox9和Collagen II的表達（C-E），進一步研究發現Smad2沉默減弱了軟骨細胞的細胞增殖能力（F）。通過WB和qRT-PCR實驗發現Smad2過表達能消除CircCDK14沉默或者miR-125a-5p過表達對Sox9和Collagen II的影響（H）。綜上所述，我們的結果顯示Smad2是CircCDK14/miR-125a-5p軸的主要調節因子，其在軟骨細胞中表現出與CircCDK14類似的功能。

6. CircCDK14在體內對骨關節炎的作用
    作者構建兔模型探討CircCDK14在體內對骨關節炎的作用，FISH和qRT-PCR實驗評估CircCDK14、miR-125a-5p和Smad2的過表達水平（A），番紅O和固綠染色顯示注射WT AAV CircCDK14后關節表面軟骨層明顯增厚，而miR-125a-5p過表達減弱了這一影響（B）。免疫組織化學和WB分析表明注射WT AAV CircCDK14后軟骨細胞中MMP3和MMP13的表達下降，Smad2、Sox9和Collagen II的表達上升；miR-125a-5p過表達減弱Smad2、Sox9和Collagen II的表達，而增加了MMP3和MMP13的表達（C，E）。TUNEL染色實驗表明細胞凋亡的結果與體外一致（D）。以上結果表明CircCDK14通過miR-125a-5p和Smad2的調節作用在體內行使功能。

結論：
    CircCDK14可以通過維持軟骨ECM的合成代謝和抑制分解代謝來緩和骨關節炎，這一作用是通過CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2調控軸調控的。

參考文獻：
Panyang Shen, Yute Yang, Gang Liu, et al. CircCDK14 protects against Osteoarthritis by sponging miR-125a-5p and promoting the expression of Smad2. Theranostics. 2020, 10(20): 9113-9131.