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新靶點!circRNA調控心肌肥厚

欄目:最新研究動態 發布時間:2020-07-27
心肌肥厚與正常心功能和受損心功能相關時可分為生理和病理兩大類。眾所周知,病理性心肌肥厚是心肌....

    心肌肥厚與正常心功能和受損心功能相關時可分為生理和病理兩大類。眾所周知,病理性心肌肥厚是心肌梗死、心律失常、心力衰竭甚至猝死的獨立危險因素。了解心肌肥厚和向心力衰竭過渡的分子機制對于確定逆轉適應性心臟重構甚至心力衰竭的新靶點至關重要。本文旨在探究circRNA在心肌肥厚中的調控作用及機制,本文于今年1月發表在Cardiovasc. Res雜志上。
結 果:
1、CircRNA_000203在Ang-II灌注的小鼠心肌中上調表達
    建立小鼠心肌肥厚動物模型,給予Ang-II灌注4周,體重/脛骨長度比值(HW/TL)顯著增加(圖1A)。WGA染色結果顯示Ang-II灌注小鼠心肌細胞尺寸明顯增大(圖1B)。心肌肥厚小鼠中可觀察到ANP和β-MHC蛋白表達顯著增加 (圖1 c)。RT-qPCR結果證實,在灌注ANG - II的小鼠心肌中,circRNA_000203及其親本基因Myo9a mRNA的表達一致上調(圖1D-E)。

圖1 CircRNA_000203在Ang-II灌注的小鼠心肌中上調表達

2、CircRNA_000203在Ang-II誘導的NMVCs細胞中上調
    本文采用ANG - II誘導的NMVC肥大細胞模型。NMVCs細胞大小明顯增加,Ang-II-treated NMVCs細胞中ANP和β-MHC表達顯著升高 (圖2 a、2 b)。同樣,在ANG - II處理的NMV中,circRNA_000203、Myo9a、Anp和Myh7 mRNA也顯著上調(圖2C)。circRNA_000203,而不是Myo9a mRNA,對RNase R處理具有抗性(圖2D)。此外,使用
Dactinomycin  D抑制RNA轉錄,并測量了Dactinomycin  D處理后NMVCs不同時間點的circRNA_000203和Myo9a mRNA的水平。Dactinomycin  D處理后4、8、12 h, circRNA_000203的相對表達量明顯高于Myo9a mRNA的表達量(圖2E)。此外,FISH和RT-qPCR檢測顯示,環狀RNA在NMV中主要分布于細胞質 (圖2F, 2G)。

圖2 CircRNA_000203在Ang-II誘導的NMVCs細胞中上調

3、CircRNA_000203增強了NMVCs肥厚
    本文利用重組circRNA_000203腺病毒rAd-circ203介導過表達circRNA_000203在NMV中的表達。在感染了rAd-circ203的NMVC中,細胞大小顯著增加(圖3A)。NMVCs中,circRNA_000203而非Myo9a mRNA水平顯著升高,Anp和Myh7 mRNA水平顯著升高(圖3B)。一致,蛋白表達的ANP和β-MHC也顯著增強執行表達式的NMVCs circRNA_000203(圖3 c)。

圖3 CircRNA_000203增強了NMVCs肥厚

4、過表達circRNA_000203可在體內加重ANG - II誘導的心肌肥厚
    在Tg-circ203小鼠心肌中,circRNA_000203而非Myo9a mRNA高表達(圖4A)。在本文中,在小鼠體內建立了Ang-II灌注4周的肥厚動物模型。超聲心動圖顯示ANG - II灌注的Tg-circ203小鼠心臟結構和功能的變化。加入ANG - II的Tg-circ203小鼠EF和FS顯著降低(圖4B)。此外,WGA染色結果顯示,加入ANG - II的Tg-circ203小鼠心肌細胞的大小顯著增加(圖4C)。免疫印跡結果表明,ANP的表達和β-MHC也顯著增強心肌的Ang-II-infused Tg-circ203老鼠(圖4 d)。

圖4過表達circRNA_000203可在體內加重ANG - II誘導的心肌肥厚

5、鑒定miR-26b-5p和miR-140-3p作為circRNA-000203的海綿靶點
    序列分析顯示,在circRNA_000203中,miR-26b-5p有兩個潛在的結合位點(nt 607 628和nt 702 723)(圖5A),而miR-140-3p有一個潛在的結合位點(nt 964 984)(圖5B)。而miR-26b-5p或miR-140-3p與circRNA_000203的相互作用在相應的結合位點發生突變后其信號可以被消除(圖5A, 5B)。過表達circRNA_000203的NMV中,miR-26b-5p和miR-140-3p水平顯著降低(圖5C)。RNA下拉和RT-qPCR試驗的結果表明,circRNA_000203下拉的數量miR-26b-5p-mut明顯低于miR-26b-5p(圖5 d),和circRNA_000203下拉miR-140-3p-mut也顯著低于miR-140-3p(圖5)。利用生物素標記的CircRNA_000203探針從NMVCs裂解液中有效分離出CircRNA_000203(圖5F)。同時,使用circRNA_000203探針,可以特異性地拉低miR-26b-5p和miR-140-3p,而與miR-144-3p無關的miR-144-3p(圖5F)。

圖5鑒定miR-26b-5p和miR-140-3p作為circRNA-000203的海綿靶點

6、MiR-26b-5p和miR-140-3p負調控Gata4表達
    在線預測miR-26b-5p、miR-140-3p的靶基因,圖6A-B顯示miR-26b-5p、miR-140-3p在Gata4 mRNA的3 -UTRs內的結合位置,并由熒光素酶實驗證實。與陰性對照相比,轉染miR-26b-5p、-140-3p mimic后,NMV中Gata4的mRNA和蛋白表達顯著降低 (圖6C)。如預期,過表達circRNA_000203的NMVC中,Gata4的mRNA和蛋白表達顯著升高 (圖6D)。此外,我們還觀察到加入ANG - II的Tg-circ203小鼠心肌的Gata4 mRNA和蛋白表達顯著增加 (圖6E)。

圖6 MiR-26b-5p和miR-140-3p負調控Gata4表達

7、MiR-26b-5p和miR-140-3p可消除circRNA_000203在NMV中促肥大作用
    研究了miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA對ANG - II處理的NMVCs肥大的一致影響。FITC-Phalloidin染色顯示,在經過ANG - II處理的NMVCs中,細胞大小顯著增加,但分別轉染miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA后,這種細胞大小增加的情況可以被逆轉(圖7A)。Ang-II-treated NMVCs中,ANP、β-MHC和GATA4的蛋白表達是顯著增強,但miR-26b-5p、140-3p和GATA4 siRNA轉染后其表達回降(圖7B)。FITC-Phalloidin染色結果顯示,過表達circRNA_000203的NMVCs細胞尺寸明顯增加,但miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA可以降低細胞大小(圖7C)。此外,circRNA_000203-modified NMVCs細胞中ANP的蛋白表達、β-MHC和GATA4表達是顯著增加,但miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA 轉染后其表達下調(圖7 d)。

圖7 MiR-26b-5p和miR-140-3p減輕circRNA_000203對NMV的促肥大作用

結 論:
    總之,研究表明,circRNA_000203在心肌肥厚中上調,在體內和體外均促進心肌肥厚生長。CircRNA_000203可海綿化miR-26b-5p、-140-3p,增加GATA4表達,促進心肌肥厚(圖8)。

圖8 圖形摘要

 


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