長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)在多種生物過程中都作為調節因子發揮作用，但針對lncRNAs在急性心肌梗死(AMI)中的作用機制尚未明確闡明。文章“LncRNA 2810403D21Rik/Mirf promotes ischemic myocardial injury by regulating autophagy through targeting Mir26a”則填補了這一領域的空缺，闡述了lncRNA2810403D21Rik/AK007586/Mirf(心肌梗死調節因子)是如何通過調節Mir26a(MicroRNA 26a)抑制細胞大自噬/自噬。

摘 要：
    Mir26a被抑制在體外和體內都會導致心臟損傷，而過度表達Mir26a通過靶向Usp15(泛素特異性肽酶15)激活自噬而減輕缺血應激誘導的細胞死亡。更重要的是，2810403D21Rik/Mirf作為Mir26a的競爭性內源性RNA(Cerna)；2810403D21Rik/Mirf的強制表達下調Mir26a以抑制自噬。相反，2810403D21Rik/Mirf缺失導致Mir26a上調以促進自噬并減輕心臟損傷，這反過來又改善了MI小鼠的心功能。這項研究鑒定了一個lncRNA 2810403D21Rik/Mirf，它通過對Mir26a的ceRNA活性起到抗自噬分子的作用。
技術路線：

一、 Mir26a在MI中的心臟保護作用：自噬作用
    Mir26a在MI小鼠（圖一A）和 H2O2處理的新生小鼠心肌細胞（NMCMs）（圖一B）中減少。AMO-26a是Mir26a抑制劑，用AMO-26a轉染NMCMs 24 h，然后再轉染tandem-LC3構建體(GFP-MRFP-LC3)24 h，可觀察到NMCM中自噬體(黃斑點)和自噬溶酶體 (紅斑點)的數量減少（圖一C）。Mir26a的敲低使SQSTM1/p62蛋白水平升高，LC3-II表達降低（圖一D）。Mir26a海綿轉基因小鼠（Mir26a KD）小鼠中Mir26a表達下調（圖一E）。內源性Mir26a的沉默降低了左心室射血分數和左心室短軸縮短率（分別為EF和FS；圖1F），左心室功能受損。抑制Mir26a阻礙自噬小體的形成，導致Mir26a KD小鼠心臟自噬的下調(圖1G)。

    將Mir26a 模擬物轉染到NMCMs中，Mir26a過表達可減輕H2O2對NMCM細胞活力的抑制作用（圖二A），同時可以增強促進了自噬體的形成和自噬體-溶酶體的融合（圖二B），而自噬拮抗劑3-甲基腺嘌呤3-MA可以抑制這兩種效應。
    尾靜脈注射膽固醇偶聯Mir26a模擬物（AgoMir26a）到小鼠體內進行過表達，然后建立MI小鼠模型。Mir26a過表達改善了MI模型小鼠的心臟功能并縮小了梗死面積（圖二C & D），增強MI小鼠的自噬活性（圖二E），使MI小鼠自噬相關蛋白的異常表達正常化（圖二F）。

二、心肌保護作用的信號轉導機制Mir26a：Usp15的抑制
    利用TargetScan miRNA數據庫計算分析發現，編碼Usp15的基因包含了Mir26a的種子序列，序列比對顯示小鼠，大鼠和人Mir26a和Usp15基因之間的互補性，種子區中匹配的堿基對用紅色和綠色標出（圖三A）。
    MI小鼠心臟梗死邊緣區和暴露于H2O2的心肌細胞中Usp15表達呈上調（圖三B，C）。構建攜帶野生型（WT）Mir26a結合位點或Mir26a結合位點突變版本的熒光素酶表達載體。共轉染過表達Mir26a可抑制攜帶WT Usp15結合位點的熒光素酶載體或結合位點1突變（mut-1）的熒光素酶活性，但不抑制攜帶位點2突變（mut-2）或同時攜帶位點1和2（mut-3）的熒光素酶活性（圖三D）。Mir26a降低USP15蛋白水平，AMO-26a增加USP15蛋白水平，但兩者都不影響Usp15的轉錄（圖三E & F）。Mir26aKD小鼠中USP15表達上調（圖三G）。NMCMs中Mir26a的強制表達抑制了SQSTM1的表達，并促進LC3-I向LC3-II的轉化（圖三H）。

三、LncRNA2810403D21Rik/Mirf能夠與Mir26a結合并調節其活性
    使用Miranda數據庫在具有Mir26a結合位點的小鼠中鑒定lncRNA，根據它們在MI小鼠中的表達譜過濾候選lncRNA，選擇在MI小鼠中顯著上調的lncRNA AK007586進行進一步分析，并命名為2810403D21Rik/Mirf（圖四A）。
    經H2O2處理后，NMCM中2810403D21Rik/Mirf的表達顯著增加（圖四B）。原位雜交顯示2810403D21Rik/Mirf主要位于NMCM的細胞質中（圖四C）。2810403D21Rik/Mirf過表達會抑制NMCM中Mir26a的表達（圖四D），而ShRNA沉默2810403D21Rik/Mirf則導致Mir26a上調（圖四E）。
    構建包含2810403D21Rik/Mirf序列片段的Mir26a傳感器熒光素酶載體，此序列包括并入熒光素酶基因的3‘-UTR中的Mir26a結合位點（圖四F）。2810403D21Rik/Mirf的過表達增加了熒光素酶的活性，使其沉默則具有相反的效果（圖四G）。Mir26a顯著抑制傳感器載體的熒光素酶活性，這種抑制可被WT 2810403D21Rik/Mirf的共表達緩解，而mut-2810403D21Rik/Mirf不能（圖四H）。過表達Mir26a抑制WT 2810403D21Rik/Mirf熒光素酶載體的熒光素酶活性，但不抑制mut-2810403D21Rik/Mirf熒光素酶載體的熒光素酶活性（圖四I）。
    構建生物素標記的2810403D21Rik/Mirf特異性探針，并進行RNA親和分離實驗，miRNA、miRNA靶RNA和AGO2形成RNA誘導沉默復合物(RISC)介導miRNA誘導的基因沉默。RNA親和分離實驗顯示2810403D21Rik/Mirf與AGO2相互作用（圖四J），qRT-PCR顯示2810403D21Rik/Mirf與Mir26a結合（圖四K）。將生物素化的Mir26a轉染心肌細胞用于基于生物素的親和分離實驗，發現2810403D21Rik/Mirf被Mir26a拉下（圖四L & M）。綜上所述，這些結果表明2810403D21Rik/Mirf直接與Mir26a和AGO2相互作用形成RISC，并調節Mir26a的表達和活性。

四、lncRNA2810403D21Rik/Mirf作為經由Mir26a-Usp15軸的自噬調節因子
    用2810403D21Rik/Mirf轉染NMCMs。2810403D21Rik/Mirf過表達降低NMCMs的活性，加重H2O2誘導的NMCMs心肌損傷，而Mir26a可部分緩解這種影響（圖5A，B）。2810403D21Rik/Mirf的強制表達減少了NMCM中自噬小體和自溶酶體的數量（圖5C）。2810403D21Rik/Mirf過表達增加了SQSTM1的表達，并抑制了LC3-II，ATG7，BECN1和ATG5的表達（圖5D）。強制表達Mir26a減輕2810403D21Rik/Mirf對自噬的抑制（圖5C，D）。這些結果表明，2810403D21Rik/Mirf限制了Mir26a/Usp15軸的功能，從而抑制自噬并通過減輕固有的心臟保護活動引起心肌損傷。

    沉默2810403D21Rik/Mirf可減輕H2O2誘導的心肌損傷，這一作用可被AMO-26a敲除Mir26a或3-MA抑制NMCM中的自噬而逆轉（圖六A）。使用si-ATG5、氯喹或Pepstatin A/E64d阻斷自噬可恢復2810403D21Rik/Mirf沉默在H2O2處理的NMCM中的促存活效應（圖六B）。western blot顯示可恢復H2O2誘導的自噬相關蛋白的異常表達，這些調節變化通過添加AMO-26a或3-MA而減弱（圖六C）。2810403D21Rik/Mirf沉默減輕了H2O2誘導的NMCM中自噬的抑制，通過添加Mir26a抑制劑或3-MA有效地恢復了抑制(圖6D)。這些數據表明2810403D21Rik/Mirf沉默通過激活Mir26a和自噬保護H2O2誘導的心肌細胞損傷。

    f-2810403D21Rik/Mirf（含有Mir26a結合位點的2810403D21Rik/Mirf序列的25nt片段）的引入可抑制NMCM的活力，這種作用被Mir26a消除（圖七A）。f-2810403D21Rik/Mirf在NMCM中具有抗自噬作用，可以通過引入Mir26a來消除（圖七B）。f-2810403D21Rik/Mirf的強制表達通過調節Mir26a干擾自噬相關蛋白的表達，這些效應幾乎被Mir26a完全逆轉（圖七C）。這些結果表明f-2810403D21Rik/Mirf可以模擬2810403D21Rik/Mirf對自噬和細胞損傷的作用，表明Mir26a結合位點是2810403D21Rik/Mirf的功能域。

五、沉默2810403D21Rik/Mirf減輕心肌損傷并保護心肌梗死小鼠的心功能
    將攜帶2810403D21Rik/Mirf特異性shRNA的腺病毒相關病毒(AAV)-9注射到小鼠體內，以評估2810403D21Rik/Mirf抑制對心臟損害的影響。抑制2810403D21Rik/Mirf后WT小鼠心臟中Mir26a的表達上調（圖八A）。
    敲除2810403D21Rik/Mirf在WT小鼠中誘導Mir26a上調（圖8A）。2810403D21Rik/Mirf缺失改善了MI后小鼠的心臟功能并縮小了梗死范圍（圖8B，C）。2810403D21Rik/Mirf的敲除增加了自噬小泡(箭頭)的數量，并促進了MI心臟的自噬（圖8D）。western blot顯示2810403D21Rik/Mirf在MI小鼠中的抑制恢復了SQSTM1和USP15的上調，挽救了ATG7，BECN1和ATG5的下調，并促進了LC3-I向LC3-II的轉變（圖8E）。這些結果表明，沉默2810403D21Rik/Mirf可能調節自噬，并對缺血性損傷提供保護作用。