近期，Nature與Cell相繼發表文章討論染色體外環狀DNA（eccDNA）。人體有基因組，包括22對常染色體和1對性染色體。 國加州大學圣地亞哥分校Ludwig癌癥研究所的Paul Mischel教授領導的研究團隊發現，大量的癌基因并不在染色體上，而是會從染色體上脫落下來，變成一種小型的DNA，稱為染色體外DNA（ecDNA），后被驗證染色體外DNA為環狀，因此也稱為染色體外環狀DNA (eccDNAs)。EccDNA在許多類型的癌癥中很常見，它們由染色體基因形成并促進腫瘤發生。癌癥患者血液的篩查顯示，血漿中也可發現<2 kb eccDNA。在肺癌患者健康的肺組織中發現<2 kb eccDNAs，這表明eccDNA從惡性組織遷移或在健康組織中形成。
    健康供體的血漿中eccDNA進行了鑒定，鑒定結果高達20 kb。 作者假設健康組織還包含較大的eccDNA，其大小足以包含一個或幾個全長基因，原因 (1) 在人類腫瘤中發現大于100kb的eccDNA，最有可能是由隨機突變過程引起的，有望從基因組的所有部分形成eccDNA； (2)已知缺失會在酵母和牛中產生eccDNA。 (3)體細胞中的缺失大小可達6Mb。

發表期刊：Nature Communication影響因子：11.878實驗方法: eccDNA-seq RNA-seq
技術路線:

一、健康男性中全基因組eccDNA的全基因組檢測
    eccDNA測序結果充分體現了基因組水平成環的多樣性。eccDNA來源十分豐富，同一個基因有可能會產生非常多的環狀，同樣一個環狀也不僅僅只會包含一個外顯子。TTN基因就是一個非常典型的例子。該基因長度達到了0.3Mb，而這樣一個基因竟然能衍生得到130個eccDNA，是一個經典的編碼基因區域成環的案例。其中比較有代表性的是43-66以及44-52號外顯子所組成的環狀分子。eccDNA測序的目的正是在組學的層面上全面的描述刻畫eccDNA的成環多種可能性。

                                                                           圖1 來源于TNN基因的兩例eccDNA

二、EccDNA的數量和大小
    從16個肌肉樣品中鑒定出10萬多種不同的eccDNA(n = 138,027)(補充圖1c-e)。所有染色體均以eccDNA序列表示，其總長度為人類基因組的12.6％(389.5 Mb)。帶有高度自信（高置信度的）的EccDNA大小從0.05μkb到57.8μkb不等，在0.1μkb和5μkb處有兩個明顯的峰(圖2a,b)。然而，鑒于較寬的conf間隔，使用當前樣本量可能會忽略不活躍和活躍男性的eccDNA計數之間的顯著差異(圖2a，b)。我們發現每100個白細胞核中有3.5-5.6個不同的eccDNA，而肌肉組織中每100個核中有0.85-0.93個不同的eccDNA。

                                                                         圖2 eccDNA長度分布和來源多樣性

三、eccDNA基因組分布
    多數eccDNA(99％)小于25 kb(圖2a，b，圖3a，補充圖3a，b;補充圖4)，而其余1％來自斷點，相距大于25 kb (圖3b)。所有eccDNA的一半以上來自基因或假基因區域(血液55％，組織52％)。例如，樣品T8中的11.1kb [S100A3-S100A4circle 153,512-153,523kb]包括S100A3和S100A4的完整基因以及S100A5的部分基因。 S100A4編碼一種蛋白質，該蛋白質在腫瘤細胞的轉移擴散中起因果作用。

                                                                              圖3 eccDNA的染色體分布

四、eccDNA成環驗證
    eccDNA的形成與經典的circRNA具有相似性，也是經過核酸序列的反式鏈接得到的產物。對于環狀的結構驗證可以模仿circRNA，針對結合位點，就是鏈接位點設計發散引物和收斂引物進行PCR擴增，然后通過Sanger測序的方式驗證eccDNA的接頭序列。

                                                                            圖4 EccDNA驗證和DNA缺失

五、染色體17和19的成環可能性較大
    eccDNA的基因組分布表明，富基因的染色體17和19比每條Mb分別使eccDNA的平均頻率分別高1.7倍和2.9倍。

                                                            圖5 EccDNA相對于染色體的頻率，基因密度和轉錄

六、eccDNA具有轉錄活性
    轉錄本數據表明，至少有一部分eccDNA存在于細胞核中，并沒有被隔離在組織的轉錄無活性的區室中。 eccDNA轉錄本進一步排除了檢測到的eccDNA僅僅是細胞凋亡驅動的片段化的副產物的可能性，如對于<2-kb eccDNA(microDNA)44所建議的那樣，或者是在eccDNA純化過程中產生的。

                                                                 圖6 HIP1形成eccDNA具有轉錄活性
結論:
    （1） eccDNA在健康人組織和血液中很常見，其大小足以攜帶一個或幾個完整基因。
    （2）eccDNA由介于0.05—999.8 kb之間的染色體斷點形成。eccDNA具有轉錄活性，并且eccDNA通過表達全長或截短的基因來促進表型變異。
    （3）表型變異復制和轉錄的無中心的eccDNA對細胞影響重大，因為有絲分裂中的錯分會產生可變的eccDNA拷貝數。
參考文獻：
    M Ller H D , Mohiyuddin M , Prada-Luengo I , et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):1069.