神經肽血管活性腸肽（VIP）通過調節3型先天性淋巴樣細胞（ILC3）活性賦予腸道粘膜免疫力，這一成果由澳大利亞維多利亞墨爾本大學Gabrielle T. Belz、Cyril Seillet等研究人員合作完成。2019年12月23日， 《Nature Immunology》在線發表了這一最新研究成果“The neuropeptide VIP confers anticipatory mucosal immunity by regulating ILC3 activity”。IF=27.586 。該研究發現了ILC3s的功能在一天中不是恒定的，而是在活躍期和靜止期之間振蕩。腸內ILC3s的協同反應依賴于食物誘導的神經肽血管活性腸肽 (VIP)的表達。腸ILC3s具有高表達的G蛋白偶聯受體血管活性腸肽受體2 (VIPR2)，VIP激活顯著增加了IL-22的產生和上皮的屏障功能。相反，通過VIPR2的信號缺失導致ILC3s生成IL-22的能力受損，并增加炎癥誘導的腸道損傷的易感性。因此，內在細胞節律與食物攝入的循環模式協同作用，驅動IL-22的產生，并通過ILC3s中的VIP–VIPR2途徑同步保護腸上皮。

結果一、ILC的細胞因子產生全天振蕩
    上皮細胞表現出轉錄調控的晝夜波動，可以暫時調控上皮的完整性29。為了研究ILC在胃腸道中的轉錄組和功能是否受到周期性調節，將C57BL/6小鼠飼養在嚴格的24小時暗光周期下（開燈12 h，開燈時間記為t 0），隨意喂食。在體外用細胞刺激細胞后，在第4天（光照開始后4小時）和第16天（光照后4小時）分離出從小腸，肺和腸系膜淋巴結分離的ILC和其他淋巴細胞產生細胞因子的能力。佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯（PMA）和離子霉素持續4.5小時。這些數據表明，在淋巴細胞中，ILC2和ILC3對時間調節特別敏感。
    為了更好地了解IL-5和IL-22產生變異的性質，分析了這些細胞因子的離體表達，在t4，t10，t16和t23時在小腸和肺的ILC2s和ILC3s中沒有進一步刺激。結果表明，ILCs在基因調控中表現出明顯的周期性，特別是在腸粘膜免疫保護的關鍵基因中。

                                                        圖1:野生型小鼠的ILC2和ILC3活性在穩態的活動和靜止階段振蕩

結果二、內在的時鐘基因部分調節ILC中的細胞因子
    為了了解如何調節ILC功能的節律性，檢查了生物鐘基因Arntl的貢獻，該基因在調節蛋白質（特別是細胞因子）的振蕩產生中起著關鍵作用。 芳烴受體核轉運子像蛋白1（ARNTL）有節奏地與DNA結合以激活核心時鐘基因2的表達。 將來自野生型和Il7rCre×Arnt1 fl / fl小鼠的骨髓細胞的均等混合物（以下稱為ArntlΔIL7R）混合在一起，這些混合物在所有淋巴樣譜系中均有條件缺失Arnt1（數據未顯示），注入經致死劑量照射的野生動物中 類型的收件人。結果表明，ARNTL對于IL-22的基礎表達很重要，但是它僅部分控制ILC3中IL-22的節律性產生。

                                                          圖2:分子鐘僅部分調節細胞因子分泌的晝夜節律表達

結果三、熱量攝入與ILC節律性同步
   接下來，調查了腸外ILC3s中IL-22的節律性產生是否受外在因素調控。 首先，追蹤了整個24小時明暗循環中的小鼠食物消耗。為了測試微生物群是否可能導致食物限制后ILC產生細胞因子的頻率增加，對僅在黑暗階段（t12 –t24）或光照階段（t0 –t 12）喂養的野生型小鼠進行連續治療， 在飲用水中使用抗生素2周。 對照小鼠不接受抗生素治療，隨意進食。 這些觀察結果表明，與食物消耗有關的外在信號是小腸ILC3s局部調節IL-22產生的原因，而引流淋巴結或肺部的ILC3則不受影響。

                                                          圖3:食物攝入調節腸ILC2s和ILC3s的細胞因子分泌

結果四、腸ILC3表達神經肽受體VIPR2
    為了闡明控制腸道ILC中觀察到的組織特異性調控程序的機制，對來自小腸和野生型小鼠結腸的t-4時分選的Lin-CD127+ CD90+ ILC進行了單細胞RNA–Seq 在12小時的光照/ 12小時的黑暗周期中，隨意進食。 使用t分布隨機鄰居嵌入（t-SNE）進行的數據分析34區分了8種。 因此，腸中的ILC3表達VIPR2，并位于VIP +神經元附近，在進食后頻率增加而在禁食后減少。

                                                       圖4: 腸ILC3子集表達VIPR2，并位于表達VIP的神經元附近

結果五、飼養協調ILC3s中IL-22的產生
    為了評估暴露于VIP是否在ILC3s中調節細胞因子的產生，刺激了從野生型小鼠固有層分離的CD45 +淋巴細胞，在存在或不存在VIP的情況下用IL-7和IL-23禁食16 h，持續4.5 h。模擬用cAMP直接刺激并激活蛋白激酶39的二丁酰環AMP（d-cAMP）被用作繞過VIPR2參與的陽性對照。這些發現表明，體外VIP信號傳導可以通過在ILC3上直接激活VIPR2來增強IL-22的產生。接下來，腹膜內注射VIP或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）到野生型小鼠中，并在注射后2 h從小腸分析了Lin-Gata3+Rorγt-ILC2s和Lin-Gata3-Rorγt+ NKp46 +/- ILC3s。 Vipr2-/-小鼠的腸道ILC子集數量相似，包括CD4 +和CD4-ILC3，與野生型小鼠相比（擴展數據圖7b）表明，VIPR2不是腸道中ILC3的發育或維持所必需的。因此，VIP–VIPR2軸推動了腸道ILC3s體內IL-22的分泌。

                                                           圖5: VIP直接調節白細胞介素3產生的IL-22

                                                           圖6: VIPR2信號調節體內ILC3分泌的IL-22

結果六、ILC3s中的VIPR2維持上皮屏障
    為了測試VIP是否在維持腸道上皮屏障中起作用，用低劑量的DSS（1.5％wt / vol）處理野生型和Vipr2-/-小鼠5 d。結果表明，盡管其他腸道淋巴細胞可能會導致Vipr2-/-小鼠腸道破壞的嚴重程度，但VIPR2+ ILC3在DSS誘導的炎癥過程中對腸道上皮的保護具有重要作用。

                                                        圖7: VIPR2信號對于調節體內腸道完整性至關重要

                                                       圖8:VIPR2?/ ?ILC3s提供保護免受DSS誘導的炎癥
結論：
    該研究確定了調節腸中IL-22表達的信號之一，并且可能在與IL-22相關的免疫病理學中也很重要。這些觀察結果揭示了一些機制，這些機制將腸道中的保護性反應與腸道中的刺激性負荷相匹配，并可能協調體內穩態組織修復途徑的誘導。