NH3是一種已知的有害氣體，會對我們的呼吸系統造成傷害。NH3存在于陰霾中，會形成二次有機氣溶膠，進入呼吸道對健康產生不利影響。但是，尚未確定由NH3引起的氣管的具體損害機制。ceRNA調控機制及其多種作用已在許多病理機制中提出。本文作者以肉雞為材料，研究了NH3吸入后ceRNA在雞氣管中的功能作用。本文于2019年11月發表在Journal of Hazardous Materials（IF：7.65）上。
本文思路如下圖所示：

本文研究結果如下：
1、氣管細胞超微結構觀察
   如圖1，透射電鏡下正常對照（C組）氣管細胞形態正常，細胞膜邊緣清晰完整，線粒體大小正常，無異常結構變化。 然而，NH3暴露組（H組）具有許多細胞壞死的典型特征，包括集中的纖毛細胞核，核仁缺乏，線粒體腫脹，空泡化，甚至細胞質破裂，伴隨細胞膜破裂。以上證實，NH 3可以誘導氣管細胞壞死。

                                              圖1 用透射電鏡(TEM)觀察暴露于NH3的氣管

2、lncRNAs和miRNAs的聚類分析
   RNA測序中鑒定出79個差異表達的lncRNA（DE-lncRNA）（圖2A）和21個差異表達的miRNA（DE-miRNA）（圖2C）。此外，作者發現lncRNA-107053293和miR-148a-3p（圖2 B，紅色方框所示）在調控NH3代謝過程中可能是重要的功能原件，因而以此為目標進行下一步分析。

                                              圖2 lncRNAs和miRNAs的聚類分析

3、lncRNA-107053293和miR-148a-3p對NH3暴露后氣管中FAF1表達的影響
   圖3 A是作者篩選的5條顯著差異表達的lncRNA進行qRT-PCR驗證，其中lncRNA-107053293差異最顯著。此外，qRT-PCR顯示miR-148a-3p在H組中顯著上調表達（圖3B）。miR-148a-3p的靶基因FAF1（已知的抑制細胞凋亡）在H組中顯著下調表達（圖3C和D）。所以作者猜測氣管在暴露于NH3引發的凋亡可能與lncRNA-107053293和miR-148a-3p有關。

                                        圖3 lncRNA-107053293、miR-148a-3p、FAF1在氣管中的表達水平

4、NH3暴露后氣管內壞死相關基因的表達
   基于FAF1的表征，作者檢測了RIPK1，RIPK3，MLKL，FADD和caspase 8的表達，這些蛋白均與細胞壞死有關。正如預期，暴露于NH3后，氣管中RIPK1，RIPK3，MLKL和FADD表達都升高了。并且在mRNA水平上，FADD，RIPK1和RIPK3表達升高超過2倍，而MLKL增加1.5倍，caspase 8減少約60％（圖4A）。類似的，上述蛋白的蛋白水平表達趨勢得出一致的結論（圖4B）。結合前人的研究，caspase 8下調細胞壞死會增加，因此，作者得出結論，NH3暴露后可能通過激活caspase 8引發氣管壞死。

                                               圖4 檢測導致氣管組織壞死的基因

5、lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用網絡
   亞細胞定位顯示lncRNA-107053293主要在細胞質中表達（圖5A），之后構建了lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1組件，如圖5B，雙熒光素酶實驗顯示三者之間確實存在結合位點可相互作用（圖5C和D）。
   此外，過表達lncRNA-107053293，miR-148a-3p的表達顯著下調，但FAF1表達水平顯著升高（圖5E和F）。相反，miR-148a-3p過表達lncRNA-107053293和FAF1的豐度都下降了，而FAF1蛋白水平下降的更為明顯（圖5G）。以上表明， lncRNA-107053293可通過螯合miR-148a-3p來調節FAF1的表達。

                                     圖5 lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用網絡

6、氯化銨致LMH（雞肝細胞癌細胞系）壞死
   作者摸索了不同濃度氯化銨用于NH3暴露的最佳濃度，如圖6A， 50 mM氯化銨殺死了一半的細胞，所以作者最終選擇5 mM濃度的氯化銨，此時細胞存活率大于95％。此外，流式結果顯示對照組中只有0.559％的細胞壞死，而當暴露于氯化銨時，有25.3％的細胞壞死（圖6B）。

                                                 圖6 CCK-8和流式檢測的結果
   為了驗證上述結果，作者檢測了氣管細胞中壞死相關基因的mRNA和蛋白質表達，如圖7A和B所示，氯化銨模擬的NH3暴露后，組織中FADD和MLKL表達增幅最大，其次是RIPK1和RIPK3。以上結果表明氯化銨可導致細胞壞死。

                                                   圖7壞死相關基因的表達
   總之，本文進一步闡明了氨致雞氣管損傷的生物學機制，為氨毒理學研究奠定了更深層次的理論基礎。此外，本文的實驗手段并不復雜，但發了7分的雜志，值得借鑒。
參考文獻：
   Wang Wei., Shi Qunxiang., Wang Shengchen., Zhang Hongfu., Xu Shiwen., (2019). Ammonia regulates chicken tracheal cell necroptosis via the LncRNA-107053293/MiR-148a-3p/FAF1 axis., J. Hazard. Mater., undefined, 121626.