近期，癌癥研究頂級期刊Cancer Cell發表了來自瑞士伯尼爾大學的Rory Johnson教授的綜述：通過CRISPR-Cas技術篩選具有治療潛力的的長鏈非編碼RNA。該文總結了新發表使用CRISPR的技術篩選與腫瘤細胞增殖和抗藥性相關lncRNAs的研究論文；并著重介紹了這一高通量、高特異性篩選方法的策略、材料和方法。小編在這和大家一起分享。

  LncRNAs（long non-coding RNAs，長鏈非編碼RNA）是一類長度在200 nt以上，不編碼蛋白質的一類RNA。它們參與眾多的生物學過程，也是目前癌癥研究中的熱門內容。其數量遠超過蛋白編碼基因，達到50000甚至更多。高通量測序方法為我們發掘新的lncRNAs提供了極大的支持。通過基因測序檢測突變或全轉錄組檢測表達量變化，已經發現了許多癌癥相關的lncRNA。如NETA1在多數實體瘤中表達量均上調并有促癌癥作用(Chakravarty, Sboner et al. 2014)。此外，基于RNAi的shRNA文庫篩選也是常使用的方法。然而單純表達量差異的篩選無法與功能聯系起來。因此，利用CRISPR-Cas9的功能性高通量篩選技術研究lncRNAs成了我們的一大利器。早在2014年，張峰課題組就報道了針對所有蛋白編碼基因的CRISPR-Cas9篩選文庫(Shalem, Sanjana et al. 2014)；這一方法目前在研究中也廣泛使用。之后研究人員在此基礎上推出了針對不同基因群的亞庫、攜帶不同活性的融合蛋白的激活或抑制文庫等。近年來，許多高水平文章報道了通過該方法發現參與各中生物學過程的新基因。而針對lncRNAs的高通量文庫在2018年才有報道(Liu, Cao et al. 2018)。接下來讓我們來學習整個實驗的設計思路。

圖1 CRISPR-Cas Screen文庫構建、感染和篩選模式圖

  如圖1所示，我們首先需要設計或購買符合我們研究目標的sgRNA文庫。例如Addgene 89640、 86538–86550、1000000106等，都十分方便研究者直接使用。這些文庫針對每一個lncRNA均設計6條sgRNA來提高結果的準確性。然后包裝病毒后感染細胞建立穩定表達相應Cas9蛋白和gRNA的細胞系。需要注意的是，使用含gRNA的病毒感染細胞時，MOI值應較低（應低于1，該文章推薦值為0.3），這樣才能保證單個細胞中只有單個lncRNA被編輯。通過抗生素等篩選方法去除未感染細胞后，便可以進行篩選實驗了。

  我們根據研究目的制定特定篩選策略。根據不同lncRNAs編輯后產生的不同表型篩選出目標組別和對照組別。如根據侵襲能力不同分選出高侵襲能力的細胞和低侵襲能力的細胞；藥物處理后根據耐藥性分選不同表型的細胞；根據帶GFP熒光標簽的目標蛋白的含量篩選目標蛋白上調或下調的細胞類群。嚴格的篩選標準和合理的對照設置能使我們的篩選結果更加準確有效。接下來便是檢測各自細胞亞群中有哪些lncRNAs被編輯。

圖2 CRISPR-Cas Screen篩選后測序檢測和分析模式圖

  提取相應細胞基因組并使用特異性引物PCR出整合的sgRNA序列后構建二代測序文庫測序，再通過生物信息學分析樣品中gRNA豐度，豐度變化的gRNA所對應的lncRNA便是調控篩選條件過程的潛在分子靶標。如此得到的靶標均是在癌癥發生過程中有調節功能的lncRNA，在經過分析和篩選后部分指標并驗證其功能后，便是你深入探究分子機制、大展身手的最佳時機。下面舉例展示部分文章的篩選和驗證結果(Zhu, Li et al. 2016)，如圖3所示。文章在Huh7OC細胞中篩選了700個lncRNAs，發現其中51個能上調或下調該細胞的生長。驗證實驗中敲除AC004463.6（圖3 f中粉色標注）后，癌細胞的生長受到顯著抑制；敲除LINC01087（圖3 g中紅色標注）后，癌細胞的生長顯著增加。當然，這種方法中也會存在著敲除作用是否高效，功能性篩選結果的機制研究困難等問題。

圖3 部分篩選指標驗證結果

  上海英拜生物多年來一直聚焦于lncRNA、miRNA、cirRNA研究的前沿，在測序篩選、機制功能研究方面均有著豐富的經驗和眾多成功案例。更多資訊可查詢公司相關產品。