環狀RNA(稱為環狀RNA)是包含許多RNA物種的共價封閉單鏈轉錄本”.近年來，高通量測序和新的研究方法表明環狀RNA的表達廣泛。許多研究已經證明環狀RNA可以作為microRNAs (miRNAs)的海綿或與蛋白結合，而環狀RNA水平的改變會導致基因產物的異常表達，從而可能導致癌癥生物學。環狀RNA在癌癥中的研究也如火如荼的進行中。2018年6月發表在JOURNAL OF HEPATOLOGY（IF=14.911）上的一篇名為“Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma. ”的研究揭示了環狀RNA cSMARCA5在肝癌的發生發展中的機制。為我們提供了一種circRNA“教科書式”的研究思路。在本研究中，通過RNA測序(RNA-seq)，比較了成對的HCC和鄰近的非癌性肝臟(ANL)組織中環狀RNA的表達。進一步研究從SMARCA5基因的外顯子15和16中提取出一個環狀RNA 7，并將其命名為cSMARCA5(hsa_circ_0001445)。cSMARCA5在肝癌發生發展過程中的作用在體外和體內都進行了評估。由于核RNA解旋酶DHX9 (DExH-Box解旋酶9)的廣泛存在，cSMARCA5在HCC組織中的表達較低。肝癌細胞cSMARCA5下調與侵襲性特征顯著相關，是肝切除術后肝癌患者總體生存率(OS)和無復發生存率(RFS)的獨立危險因素。體內和體外數據表明cSMARCA5抑制了肝癌細胞的增殖和遷移。在機制上，cSMARCA5可以通過海綿化miR-17-3p和miR-181b-5p促進腫瘤抑制因子TIMP3的表達。為circRNA在肝癌進展中的應用提供了新的視角。

技術路線

結果

1.通過人類肝癌樣本中的RNA-seq分析鑒定circular RNAs

通過肝癌組織vs癌旁組織的RNA-seq總共檢測到了13,686 個差異表達的circRNAs ，去除低豐度的共有4727 個circRNAs， 4214 circRNAs 個存在于circBase數據庫 (圖 1A). 4142 個circRNAs (87.42%) 存在于 2322個基因的外顯子區(圖 1B), length of 外顯子 circRNAs 長度小于 1,000核苷酸 (圖1C)。在中國人群 (GSE14520, GPL3921)利用GEO2R 分析了2322 個基因在214 對HBV相關的人類HCC 以及ANL 組織差異表達的基因進行IPA分析. 236 差異表達的circRNAs, 108個上調128下調(圖1D). 通過qRT-PCR檢測了部分circRNAs 在40 對HCC 以及ANL組織的表達(圖1E)，與RNA-seq 結果一致。

2.cSMARCA5在肝癌中的特征

作者選擇了SMARCA5基因的外顯子15和16衍生的circRNA并命名為cSMARCA5進行進一步研究(圖2A)。原因如下:(1)cSMARCA5是RNA-seq中最豐富的差異表達環狀RNA之一，最近的一項研究也證實了它在人類肝臟中的豐富程度。(2) cSMARCA5在HCC中顯著下調（圖2B)，而pSMARCA5 (SMARCA5的pre-mRNA)、mSMARCA5 (SMARCA5的mRNA)和SMARCA5蛋白水平均上調。為了證實cSMARCA5的環狀特性，在SMMC-7721細胞中提取RNA，當使用oligo (dT)18引物時，與隨機六聚體引物相比，cSMARCA5的相對表達明顯下調，而mSMARCA5的相對表達沒有下調(圖2C)。這一發現證明cSMARCA5沒有多尾。此外，cSMARCA5對RNase R耐藥，表明cSMARCA5是環狀的 (圖2D)。使用放線菌素D抑制轉錄，然后測量SMMC-7721細胞中cSMARCA5和mSMARCA5的半衰期。結果表明，cSMARCA5比mSMARCA5更穩定(圖2E)。此外，qRT-PCR和FISH對cSMARCA5的原位雜交(FISH)顯示了cSMARCA5主要的細胞質分布(圖2F, G)，這些結果表明cSMARCA5是一個豐富的、環狀的、穩定的轉錄本，在HCC中顯著下調。

3.cSMARCA5在HCC中的表達可以通過DHX9調控

人體內的大部分環狀RNA“都是由具有長側向內含子的內外顯子加工而成，通常包含反向互補序列”。為了檢測cSMARCA5是否被I14RC和I16RC促進，野生型或cSMARCA5的一系列缺失結構(#2-4)分別克隆到pZW1載體 (圖3A)。轉染4種載體(#1-4)后I14RC和 I16RC缺失結構(#2-4)不能過表達cSMARCA5，說明I14RC和I16RC對于cSMARCA5的產生是不可缺少的(圖3B)。此外，qRT-PCR進一步證實了這一結果(圖3C)。接下來作者探究了為什么cSMARCA5在HCC中顯著下調，而pSMARCA5、mSMARCA5和SMARCA5蛋白水平上調的原因。敲除DHX9 (DExH-Box ase 9)， cSMARCA5明顯上調，而pSMARCA5和mSMARCA5無明顯變化(圖3D)。它可以通過與側方反向互補序列結合并抑制這些序列的配對來抑制環狀RNA的產生。cSMARCA5在使用shRNA敲低DHX9時被上調，這種效果可以通過過度表達野生型DHX9轉基因而不是‘解旋酶死亡’突變體而被挽救(圖3E)，這表明調控依賴于它的解旋酶活性我們使用DHX9抗體進行RNA免疫沉淀(RIP)，觀察到I14RC和I16RC顯著富集(圖3F)且 DHX9在HCC中明顯上調(圖3G、H)， cSMARCA5的表達與DHX9在40個HCC組織中的組織化學分數呈負相關(圖3I)。綜上所述，cSMARCA5的下調至少部分是由于HCC中DHX9的上調。

4.下調cSMARCA5表達可預測肝切除術后肝癌患者的侵襲性臨床病理特征和不良預后。

kaplan meier的生存曲線表明, 肝切除術后肝癌患者低cSMARCA5表達具有低總生存期(OS)和無復發生存(RFS) (圖4 A、B)。多變量分析表明,cSMARCA5表達水平,加上AFP,腫瘤大小、病理衛星,封裝,是一個總生存率或者復發生存率的獨立危險因素和 (圖4 C,D)。綜上所述,這些數據表明，HCC cSMARCA5降低與生長和轉移有關，可作為肝切除術后肝癌患者的獨立預后標志物。

5. 體外和體內實驗均表明cSMARCA5抑制肝癌的生長和轉移

CCK-8測定,劃痕實驗,transwell遷移試驗顯示過表達cSMARCA5肝癌細胞的生長和遷移 (圖5 A-C)。裸鼠成瘤實驗表明cSMARCA5過表達細胞抑制腫瘤生長 (圖5D)。進一步應用這些皮下腫瘤組織建立原位移植肝內轉移模型，過表達cSMARCA5肝內轉移明顯減少(圖5E)。注射裸鼠側尾靜脈，建立肺轉移模型，使用體內成像(IVIS)系統，動態監測肺轉移過程。光子通量曲線過表達cSMARCA5肺轉移明顯減少(圖5F)。8周后，解剖肺的蘇木精和伊紅(H&E)染色進一步證實cSMARCA5過表達可顯著抑制肺轉移(圖5G)。

6.cSMARCA5可以作為miR-17-3p和miR-181b-5p的海綿

在SMMC-7721和Huh7細胞中使用AGO2抗體進行RNA免疫沉淀(RIP)， cSMARCA5被AGO2抗體顯著富集(圖6A)。使用miRanda miRNA靶預測工具，發現65個可能與cSMARCA5結合的miRNA。通過circRIP純化了cSMARCA5相關的RNA，發現miR-17-3p和miR-181b-5p有特異性富集 (圖6B)，熒光素酶報告基因實驗表明miR-17-3p和l81b-5p降低了至少40%的熒光素酶報告活性(圖6C)。突變了miR-17-3p或miR-181b-5p的靶位點 , 使用這兩種熒光素酶報告基因，將相應的miRNA轉染到SMMC-7721細胞后，熒光素酶活性沒有明顯變化(圖6D,E)。此外，通過生物素偶聯的miR-17-3p或miR-181b-5p模擬物的pull down實驗，我們觀察到cSMARCA5與對照組相比有明顯的富集 (圖6F)。此外，FISH檢測顯示cSMARCA5和這兩個miRNA共定位(圖6G)

7.cSMARCA5通過miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生長和轉移

檢測過表達或沉默cSMARCA5后, miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶點TIMP3在cSMARCA5過表達時上調幅度最大，在敲除cSMARCA5時下調幅度最大(圖7A, B)。TIMP3是一種在HCC中下調的腫瘤抑制因子,可以抑制HCC的生長和轉移。外源性miR-17-3p或(和)miR-181b-5p可以顯著抑制TIMP3的表達，而過表達cSMARCA5后抑制作用減弱(圖7C)。在功能上，CCK-8檢測顯示miR-17-3p或(和)miR-181b-5p可以促進HCC細胞的生長，而過表達的cSMARCA5可以阻斷這種促進(圖7D)。Transwell遷移實驗表明，miR-17-3p或(和)miR-181b-5p可促進HCC細胞轉移，過表達的cSMARCA5可阻斷其轉移(圖7E)。此外，TIMP3的mRNA水平下調，且與cSMARCA5在HCC組織中的表達呈正相關(圖7F, G)。

原理圖